作者：陈海，孙善全，汪克建，陈通，谭戈，杨美
【摘要】 目的: 探讨aqp4与kir4.1在大鼠眼内的定位分布及二者的共表达. 方法 : 用免疫组织化学及激光扫描共聚焦显微技术检测aqp4与kir4.1在大鼠眼内的分布. 结果: 免疫荧光显示，aqp4与kir4.1在大鼠视网膜和睫状体内的分布形式相似；免疫荧光双标显示，aqp4与kir4.1在视网膜müller细胞及睫状突无色素上皮细胞的顶膜面及基底膜面呈重叠分布. 结论: aqp4与kir4.1在大鼠视网膜müller细胞及睫状突无色素上皮细胞共表达，提示二者可能具有协同作用，参与房水的产生以及视网膜内水、k+运输平衡的调节.
【关键词】 睫状体/细胞学；视网膜；水通道蛋白；钾通道，内向整流；免疫荧光组织化学与荧光双标记
0引言
眼内水、电解质的运输平衡对维持眼的多项生理功能具有重要意义. 但其异常的分子机制并不十分清楚. 水通道蛋白（aquaporins, aqps）的发现及其在眼内的广泛分布开辟了探索眼内水、电解质运输平衡的新途径［1］. 最近报道［2-3］，aqp4与kir4.1(inwardly rectifying potassium, kir)相耦联（coupling ），在脑内水、电解质运输平衡调节中发挥着重要作用. 这种耦联关系与aqp4和kir4.1在某些胶质细胞特殊膜域的共表达（colocalization）有关［4］. 本实验拟通过免疫组织化学和激光扫描共聚焦显微技术，对aqp4与kir4.1在眼内组织的定位分布及其共表达情况进行 研究 ，为进一步探讨眼内水、电解质转运平衡及其调节机制提供形态学依据.
1材料和方法
1.1材料成年wistar大鼠8只，雌雄各半，眼睛活动正常，外观正常，角膜透明、无损伤眼用于本研究. 多克隆兔抗kir4.1抗体购自sigma公司；兔抗caqp4（碳端aqp4）购自美国chemicon公司；二抗(通用型免疫组化检测试剂盒)为中山生物技术有限公司产品；fitc标记羊抗兔igg, cy3标记羊抗兔igg等均购自武汉博士德生物试剂有限公司.
1.2方法
1．2．1眼组织准备用戊巴比妥钠（40 mg/kg）经腹腔注射麻醉大鼠后，经左心室插管，用生理盐水将血液冲洗干净，再用40 g/l多聚甲醛pbs溶液灌注固定30 min. 取眼球，于40 g/l多聚甲醛pbs溶液后固定2 h. 用0.1 mol/l pbs清洗组织，依次入50,100,150,200 g/l蔗糖（0.1 mol/l pbs配置）脱水，-20 ℃恒冷冰冻切片机矢状面连续切片，片厚为15 μm.
1.2.2免疫荧光组织化学方法切片经10 mmol/l pbs漂洗30 min，3 ml/l甲醇h2o2，10~15 min，0.1 mol/l tritonx100作用10 min；正常山羊血清封闭4 h，37℃，甩干不洗，加一抗aqp4或kir4.1 (1∶400)，37 ℃孵育过夜，10 mmol/l pbs漂洗15 min×3次，二抗（fitc标记的羊抗兔igg或cy3标记的羊抗兔igg） 90 mim，37 ℃，0.01 m pbs漂洗15 min ×3次；500 ml/l甘油-10 mmol/l pbs封片，激光共聚焦显微镜观察.
1.2.3免疫荧光双标记试验10 mmol/l pbs漂洗切片30 min，3 ml/l甲醇-h2o2，10~15 min，0.1 mol/l tritonx100作用10 min；正常山羊血清封闭4 h，37℃，用aqp4一抗(1∶400)，37℃孵育过夜，10 mmol/l pbs漂洗15 min×3次，二抗(fitc标记的羊抗兔igg) 90 min， 37℃， 10 mmol/l pbs漂洗15 min×3次；正常山羊血清封闭4 h，37 ℃，加另一抗kir4.1（1∶400），37℃孵育过夜，10 mmol/l pbs漂洗15 min×3次，二抗（cy3标记的羊抗兔igg） 90 min，37℃，10 mmol/l pbs漂洗15 min×3次，500 ml/l甘油-10 mmol/l pbs封片，激光共聚焦显微镜观察.
2结果
2.1aqp4在大鼠眼内的分布aqp4阳性着色（绿色荧光）主要集中在视网膜神经层、睫状体无色素上皮细胞）以及角膜内皮细胞、晶状体上皮细胞和虹膜后色素上皮细胞（未显示），其分布主要集中在胞膜，胞质胞核未见显色（图1，2）.
a: aqp4免疫荧光标记结果； b: kir4.1免疫荧光标记结果； c: a/b相应部位的正常形态结构扫描图； d: aqp4与kir4.1双重标记结果，呈黄色部位为二者的共表达（onl: 外核层，opl: 外网状层，inl: 内核层，ipl: 内网状层，gcl: 节细胞层； : 阳性着色的müller细胞或星形胶质细胞胞体， →: müller等胶质细胞突起， : 血管周围， ↓: 内界膜， →: 感光细胞外节）.
图1激光共聚焦显微镜下正常大鼠视网膜aqp4（绿色）与kir4.1（红色）免疫荧光标记结果×400
2.2kir4.1在大鼠眼内的分布kir4.1在正常大鼠视网膜内呈明显的阳性表达，尤其是在小血管周围和内界膜等处的表达较强，其分布形式与aqp4的分布相似，阳性细胞胞体位于内核层和神经纤维层，其突起贯穿于整个视网膜神经层，与视网膜müller细胞和星形胶质细胞的形态一致；此外，kir4.1在睫状体靠近房水面无色素上皮细胞的基底膜面和顶膜面也有表达，其分布形式与aqp4在上述部位的分布相似（图1，2）.
a: aqp4免疫荧光标记结果；b: kir4.1免疫荧光标记结果；c: a/b相应部位的正常形态结构扫描图；d: aqp4与kir4.1双重标记结果，呈黄色部位为二者的共表达（→: 睫状突无色素上皮细胞， ←: 睫状突色素上皮细胞）.
图2激光共聚焦显微镜下正常大鼠睫状体aqp4（绿色）与kir4.1（红色）免疫荧光标记结果×400
2.3免疫荧光双标为进一步探讨aqp4与kir4.1在上述部位的分布特征，将aqp4抗体与kir4.1抗体进行免疫荧光双标记. 结果发现，抗aqp4免疫活性和抗kir4.1免疫活性在视网膜神经层内相叠加，尤其是在内界膜、小血管周围及感光细胞外节处，呈明显的共表达；此外，aqp4与kir4.1在睫状体的分布也有重叠，二者共表达于无色素上皮细胞（npe）的顶膜面及基底膜面（图1，2）.
3讨论
水通道蛋白是一组与水通透有关的膜转运蛋白，广泛分布于机体多处涉及水分子快速跨膜转运的部位，在维持体内水、电解质运输平衡中发挥着重要作用［2］. aqp4是脑和眼内分布最多、最广泛的水通道蛋白之一，兼有水运输平衡及渗透压感受器的双重功能，在脑和视网膜内水、电解质运输平衡以及眼内压恒定的调节等方面发挥着重要作用［2，5-8］.
有 研究 ［3-4］表明，aqp4介导的快速跨膜水转运与kir4.1介导的k+跨膜转运呈功能性耦联，二者互相协同，在脑内水、电解质运输平衡中发挥着重要作用. 这种耦联关系与aqp4和kir4.1在某些胶质细胞特殊膜域的共表达有关［4］. 在眼内，包括房水的产生及其渗透压平衡的调节、角膜和晶状体透明性的维持以及正常视觉信号的传导等多种功能活动均涉及水、k+运输平衡. 但迄今为止，仅见有关aqp4与kir4.1在视网膜müller细胞某些膜域的共表达报道［4］，尚不清楚二者在眼内其它涉及水、k+快速跨膜转运部位是否有类似的分布和功能关系？
本试验通过免疫组织化学、荧光双标记以及激光扫描共聚焦显微技术，对aqp4与kir4.1在正常大鼠眼内组织的分布及其共表达情况进行了研究. 结果发现，aqp4与kir4.1在视网膜内的分布形式相似，呈散在分布于整个视网膜神经层，阳性细胞胞体位于内核层及神经纤维层，在包绕小血管周围以及毗邻玻璃体处的müller细胞终足膜处呈强阳性分布；二者在内界膜和小血管周围等处呈明显共表达. 此外，aqp4与kir4.1在睫状体无色素上皮细胞（npe）膜上均有表达，其分布形式相似，二者在npe顶膜面及基底膜面呈共表达. 上述结果提示，二者可能具有协同作用，参与房水的产生以及视网膜内水、k+运输平衡的调节.
从组织发生的角度看，视网膜是脑的一部分. müller细胞是哺乳动物视网膜内主要的胶质细胞，兼有多项脑内胶质细胞的功能，包括快速转移神经元兴奋后局部高浓度的k+和多余水分子入血液或玻璃体，以维持视网膜内水、电解质运输平衡和神经细胞的正常兴奋性. aqp4与kir4.1在视网膜müller细胞包绕小血管周围以及毗邻玻璃体处的终足膜上大量分布和共表达，提示aqp4与kir4.1在视网膜实质与微血管和玻璃体之间水、k+跨屏障转运中发挥着重要作用，二者可能呈功能性耦联关系，互相协同，共同促进神经元电兴奋过程中突触周围间隙多余水分子和k+的跨膜转运. 此外，aqp4与kir4.1在视网膜内星形胶质细胞胞膜和müller细胞其它膜域呈较弱的共表达，其生理意义以及在缺血、缺氧、炎症等病理条件下的变化和作用尚有待进一步研究.
近年来由于许多新技术的 应用 和水通道蛋白的发现［5，9］，房水生成机制已逐渐明了. 目前 关于房水生成的机理主要是：睫状体外层色素上皮细胞(pe)内的co2和h2o在碳酸酐酶的作用下生成hco3-和h+，他们主要穿过细胞的基底侧膜分别与细胞间隙中的cl-和na+交换. 进入pe内的cl-和na+通过pe和内层的无色素上皮细胞（npe）顶膜面的缝隙连接进入npe内，然后在na+/k+/2cl-协同转运器等的作用下，被转运出npe进入房水中. 离开npe的k+在na+/k+泵等的作用下被立即摄入细胞内，并再循环. 这一过程中伴随有水分子通过睫状体上皮细胞中存在的水通道蛋白进入后房. 在上述诸多环节中，水通道蛋白与k+通道起到了关键性的作用：水通道蛋白介导着快速跨膜水转运；k+的释放不仅对渗透压差产生 影响 ，还有稳定细胞膜静息电位的作用［10］. aqp4与kir4.1在npe基底膜和顶部胞膜上的共表达，说明二者互相协同，在房水的产生过程中发挥着重要作用.
根据aqp4和kir4.1在上述部位的特征性分布形式及其共表达，我们推测：kir4.1介导的k+跨膜转运，除有利于稳定细胞膜静息电位外，还形成了一定程度的膜内、外渗透压差，有利于促进aqp4介导的跨膜水转运；同时，aqp4介导的快速跨膜水转运不仅有利于维持细胞膜内、外水分子的分布平衡，也有利于消除k+等跨膜转运所引起的膜内、外渗透压变化. 在生理状态下，二者的表达一致，呈结构和功能性耦联关系. 而在缺血、缺氧等病理条件下，二者的表达和分布分离，导致水、k+转运功能异常，引起细胞和组织水肿发生［11］，即aqp4与kir4.1失耦联.
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