【关键词】
人肺腺癌细胞；谷胱甘肽；fe3o4；内吞作用 摘要： 目的 在体外观察人肺腺癌细胞(spc-a1)对谷胱甘肽(gssg)修饰的纳米fe3o4的内吞作用及与培养温度、时间及浓度的关系。方法 通过透射电镜(tem)与普鲁士兰染色法观察spc-a1细胞对gssg修饰的纳米fe3o4的内吞作用。采用原子吸收光谱(aas)法进行spc-a1细胞粘附量及内吞量的定量分析。结果 tem结果表明，在4℃下培养24h后gssg修饰的纳米fe3o4吸附于spc-a1细胞表面；37℃下培养1h后spc-a1细胞可内吞gssg修饰的纳米fe3o4细胞数目明显增加。aas分析表明，spc-a1细胞表面纳米fe3o4的粘附量同培养时间及浓度呈正相关。gssg修饰的纳米fe3o4浓度较低(01或04mg/ml)时，内吞量在24h后达到饱和；gssg修饰的纳米fe3o4浓度较高(07或10mg/ml)时，内吞量在72h后达到饱和，单个细胞内吞量最大可达160pg。结论 spc-a1细胞对gssg修饰的纳米fe3o4的内吞需要能量，内吞量依赖于浓度及培养时间。
关键词： 人肺腺癌细胞；谷胱甘肽；fe3o4；内吞作用
endocytosis of lung adenocarcinoma cell on glutathione modified magnetite(fe3o4)nanoparticles
yan zhubing,ma yongjie,gu hongchen,et al.
institute of micro and nano science and technology,shanghai jiaotong university(shanghai 200030,china)
abstract： objective to study the relationship between endocytosis of human lung adenocarcinoma cell line spc-a1 modified by oxidized glutathione(gssg) and culture conditions including culture temperature,time and concentration.methods the uptake of gssg-modified fe3o4 nanoparticles by spc-a1 cell was observed by transmission electron microscopy (tem) and prussian blue staining.the extracellular adhesion or intracellular uptake of gssg-modified fe3o4 nanoparticles were measured by atom absorb spectrum (aas).results tem results indicated that gssg-modified fe3o4 nanoparticles adhered on the membrane of spc-a1 cell after being cultured at 4℃ for 1h or 24h,but spc-al cell could took up nanoparticles particles after cultured at 37℃ for 1h.prussian blue staining indicated that spc-al cells containing gssg-modified fe3o4 nanoparticles were much more with the prolongation of culture time or the increase of concentration.aas analysis indicated that the extracellular adhesion of gssg-modified magnetic particles was depended on culture time and concentration.the uptake amount of gssg-modiied fe3o4 nanoparticles by spc-a1 cell was saturated after 24h when the nanoparticles in low concentration (0.1mg/ml or 0.4mg/ml),the uptake was saturated after 72h when the nanoparticles in high concentration (0.7mg/ml or 1.0mg/ml).the maximal amount per spc-a1 cell could reach 160pg.conclusion the uptake of gssg-modified fe3o4 nanoparticles by spc-a1 cell is energy needed.it depends on the concentration of nanoparticles and saturates at certain time.
key words： human lung adenocarcinoma cell;glutathione;magenetite(fe3o4);endocytosis
氧化型谷胱甘肽(gssg)由还原型谷胱甘肽(gsh)氧化而成，后者广泛分布于人体各器官内。WwW.11665.cOm在体内，gssg与gsh在还原酶作用下可相互转化达到平衡状态〔1，2〕，因而fe3o4纳米粒子经过gssg修饰后可提高其生物相容性。细胞对fe3o4纳米粒子的内吞量可影响细胞内热疗〔3〕、磁共振造影的效果〔4〕。本文采用透射电镜、普鲁士兰染色法、原子吸收光谱法等定性或定量方法观察人肺腺癌spc-a1细胞对gssg修饰的纳米fe3o4的内吞作用及与培养温度、时间、浓度的相互关系。
1 材料与方法
11 磁性纳米粒子合成 fe3o4纳米粒子表面进行gssg修饰：称量705g fecl3・6h2o与297g fecl2・h2o，在磁力搅拌器上进行搅拌。温度上升到80℃后，加入20ml浓氨水，机械式搅拌器上反应30min，加入02ggssg(上海化学试剂公司)，在85℃条件下反应1h，除去氨水，将生成物用永磁铁分离出来，反复用去离子水洗涤5次，得到稳定的gssg修饰的纳米fe3o4，浓度为52mg/ml。
12 gssg修饰的纳米fe3o4的表征 透射电镜(飞利浦-tecnai20s-twin)观察生成的gssg修饰的纳米fe3o4的形貌，x-射线衍射仪(布鲁克-axs转靶x射线粉未衍射仪)测量其晶体结构。
13 透射电镜观察spc-a1细胞对gssg修饰的纳米fe3o4的内吞作用 人肺腺癌细胞
gssg修饰的纳米fe3o4的培养液，在4℃下分别培养0,3，6，12，24h后测定gssg修饰的纳米fe3o4在spc-a1细胞表面粘附量。另外设置纳米fe3o4浓度为01与04mg/ml，测定培养24h后的粘附量。测定方法按参考文献〔6〕。
15 普鲁士兰染色观察 在37℃下，处于指数生长期的spc-a1细胞与02mg／mlgssg修饰的纳米fe3o4的培养液依次培养12～24h，采用普鲁士兰染色法检测细胞内fe3+〔7〕。另外设置纳米fe3o4浓度为01或10mg／ml，培养24h后进行普鲁士兰染色。
16 spc-a1细胞对gssg修饰的纳米fe3o4内吞量的测定 在37℃下spc-a1细胞以每孔5×105的数目接种于6孔培养板，培养液体积为2ml。培养24h后，培养液更换为含gssg修饰的纳米fe3o4的培养液。纳米fe3o4浓度分别为05，1，15，20mg／ml。4种浓度下分别培养0，3，6，12，24，48，72h，测定spc-a1细胞对gssg修饰的纳米fe3o4的内吞量。测定方法按参考文献〔6〕。
2 结果
21 gssg修饰的纳米fe3o4的表征(图1) 透射电镜下，gssg修饰的纳米fe3o4为均匀的球形粒子，具有较窄的粒径分布，粒径为7～15nm。gssg修饰的纳米fe3o4在水溶液中形成磁流体，超声处理后具有良好的分散性与稳定性。样品的xrd谱表明样品的结构是立方尖晶石型。
图1 gssg修饰的纳米fe3o4的透射电镜图片(标尺为20nm)（略）
22 透射电镜观察 在4℃下spc-al细胞与02mg/mlgssg修饰的纳米fe3o4的培养液培养1h后，纳米fe3o4粘附于spc-a1细胞表面没有内化入spc-al细胞(图2a)，37℃下培养1h后gssg修饰的纳米fe3o4能够内化入spc-a1细胞(图2b)，在4℃下培养24h后，纳米fe3o4仍没有内化入spc-a1细胞(图2c)。
注：“”表示gssg修饰的磁性纳米粒子；a:4℃培养1h后的透射电镜图片；b:37℃下培养1h后的透射电镜图片；c：4℃下培养24h后的透射电镜图片
图2 不同培养条件下spc-a1细胞的透射电镜图片（略）
23 gssg修饰的纳米fe3o4在spc-al细胞表面的粘附量 gssg修饰的纳米fe3o4在spc-a1细胞表面的粘附量随着培养时间的延长而增多，gssg修饰的纳米fe3o4在spc-a1细胞表面的粘附量依赖于gssg修饰的纳米fe3o4的浓度，两者呈一定线性关系。
24 普鲁士兰染色观察 当培养液中gssg修饰的纳米fe3o4浓度为02mg／ml时，培养24h后内吞gssg修饰的纳米fe3o4的spc-a1细胞数目明显多于培养12h后的情况(图3a)。当培养时间为24h，随着培养液中纳米fe3o4浓度的增加，内吞gssg修饰的纳米fe3o4的spc-a1细胞数目明显增多(图3b、图3c、图3d)
25 spc-a1细胞对gssg修饰的纳米fe3o4的内吞量 spc-a1细胞对gssg修饰的纳米fe3o4的内吞量依赖于gssg修饰的纳米fe3o4的浓度，随着gssg修饰的纳米fe3o4浓度增加相应的内吞量也增加。当gssg修饰的纳米fe3o4浓度为01与04mg/ml时，培养24h后spc-a1细胞的内吞量达到饱和；当gssg修饰的纳米fe3o4浓度为07与10mg／ml时，培养72h后spc-a1细胞的内吞量达到饱和。单个spc-a1细胞对gssg修饰的纳米fe3o4的内吞量最大可达160pg。
注：a：gssg修饰的纳米fe3o4浓度为02mg／ml,培养时间为12h；
b：gssg修饰的纳米fe3o4浓度为02mg／ml，培养时间为24h；
c：gssg修饰的纳米fe3o4浓度为01mg／ml，培养时间为24h；
d：gssg修饰的纳米fe3o4浓度为10mg／ml，培养时间为24h
图3 普鲁士兰染色图片(200×)（略）
3 讨论
本文通过透射电镜观察到在4℃下培养1或24h后，gssg修饰的纳米fe3o4仅粘附于spc-a1细胞膜表面，没有内化入细胞。而37℃下培养1h后，spc-a1细胞能够内化gssg修饰的纳米fe3o4。证实spc-a1细胞对gssg修饰的纳米fe3o4的粘附不需要能量，内化作用需要能量。本文在4℃下研究影响gssg修饰的纳米fe3o4粘附于spc-a1细胞表面的相关因素。结果表明，粘附量与培养时间及培养液中gssg修饰的纳米fe3o4浓度均呈一定线性关系。国外众多学者研究过不同的细胞对不同fe3o4纳米粒子的内吞作用。研究结果表明，细胞对fe3o4纳米粒子的内吞与细胞类型、fe3o4纳米粒子的表面修饰、粒径_培养时间、fe3o4纳米粒子的浓度、培养温度等因素有关〔8,9〕。本文普鲁士兰染色观察结果表明，随着培养时间的延长或浓度的增加，内化fe3o4纳米粒子的spc-a1细胞数目明显增多，内化的gssg修饰的纳米fe3o4全部位于细胞质内。原子吸收光谱法检测结果表明，随着gssg修饰的纳米fe3o4浓度增加，单个细胞内的铁含量增加，其原因可能为纳米粒子浓度增加，纳米粒子的粘附量增加导致纳米粒子内化增多。spc-a1细胞对gssg修饰的纳米fe3o4的内吞量随培养时间会达到饱和则可能与细胞的生长状态及单个细胞铁的容量饱和有关。
参考文献
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(文涛编辑 张亚莲校对)
*基金项目： 国家“863”计划项目(2005aa302h10)
作者单位： 上海交通大学微纳科技研究院，上海 200030
