【摘要】 采用分散液相微萃取与气相色谱电子捕获检测联用技术建立了测定葡萄样品中百菌清、克菌丹和灭菌丹农药残留的新方法。对影响萃取和富集效率的因素进行了优化。萃取条件选定为在10 ml带塞离心试管中加入 5.0 ml葡萄样品溶液，并加入1.0 ml丙酮（分散剂），振荡摇匀后以5000 r/min离心5 min，然后将上层清液转移至另一离心试管中，加10.0 μl氯苯（萃取剂），分散混匀后再以5000 r/min离心5 min，萃取剂氯苯相沉积到试管底部，吸取1.0 μl萃取相直接进样分析。在优化的实验条件下，3种杀菌剂的富集倍数可达788～876倍；检出限在6.0～8.0 μg/kg（s/n=3∶1）范围内。以α六六六为内标，测定3种杀菌剂的线性范围为10～150 μg/kg，线性相关系数在0.9990～0.9995范围内。本方法已成功应用于葡萄样品中百菌清、克菌丹和灭菌丹残留的测定，平均加标回收率在92.3%～106.1%范围内；相对标准偏差在4.5%～7.2%之间，结果令人满意。
【关键词】 气相色谱 分散液相微萃取 百菌清 克菌丹 灭菌丹 葡萄
1 引言
克菌丹和灭菌丹为广谱治疗和保护性有机硫杀菌剂, 是苯二甲酰亚胺的衍生物。quest等[1]报道灭菌丹可以引起大鼠肾、子宫、乳腺和肝脏的肿瘤。Www.11665.com百菌清是一种非内吸性广谱杀菌剂，低毒，但是对人眼和皮肤均有刺激作用，少数人有过敏反应并引起皮炎或红疹。国家标准[2]规定水果中克菌丹残留的最高限量是15 mg/kg；百菌清在梨果类和柑桔类水果中残留低于1.0 mg/kg，在葡萄中残留量小于0.5 mg/kg。欧盟食品中农药残留限量标准规定水果中克菌丹和灭菌丹的含量要低于3.0 mg/kg，百菌清的含量要低于1.0 mg/kg。因此，建立水果中百菌清、克菌丹和灭菌丹残留量的测定方法具有十分重要的意义。
样品前处理是整个分析过程的关键一环，发展省时高效、有机溶剂用量少的样品前处理新技术一直是分析化学研究的一个热点[3～6]。目前，百菌清、克菌丹和灭菌丹残留分析中常用的提取、净化方法为液液分配[7,8]、固相萃取（spe）[9]、固相微萃取（spme）[10]和基质固相分散萃取[11]等。但是液液分配存在操作繁琐耗时，需要使用大量对人体和环境有毒或有害的有机溶剂；spe 的装置较贵，操作繁琐，不同批次生产的spe 装置重现性差，且样品用量较大；spme装置的萃取头较昂贵，寿命较短，多次使用还存在交叉污染问题。2006年，rezaee等[12]首次提出了分散液相微萃取技术（dispersive liquidliquid microextraction，dllme），该技术集采样、萃取和浓缩于一体，操作简单、快速、成本低、对环境友好且富集效率高[12,13]。zhou等［14］等先用乙腈液液萃取再进行分散液相微萃取,建立了黄瓜和西瓜中有机磷农药残留的测定方法，也有研究者将分散液相微萃取应用于菊酯类农药[15]、苯胺[16]和灭多威[17]等的测定。
目前将分散液相微萃取应用于水果中杀菌剂残留的测定还未见报道，本实验应用分散液相微萃取与气相色谱联用建立了葡萄样品中百菌清、克菌丹和灭菌丹3种杀菌剂的测定方法，取得了满意的结果。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
配有电子捕获检测器（ecd）的gc9790ⅱ毛细管气相色谱仪（福立公司），td5a型离心机（长沙英太仪器有限公司）；jj2（200361）组织捣碎匀浆机（常州国华电器有限公司）。
浓度为100.0 mg/l的α六六六（αbenzene hexachloride）、百菌清（chlorothalonil）、克菌丹（captan）和灭菌丹（folpet）标准品（农业部环境保护科研监测所）；氯苯、溴苯、四氯化碳、甲醇、丙酮、四氢呋喃、乙腈、无水乙醇和石油醚等有机溶剂均为色谱纯；水为二次蒸馏水。
将100.0 mg/l的百菌清、克菌丹和灭菌丹标准溶液混合并用丙酮稀释成20.0 mg/l的混合标准溶液。内标α六六六用丙酮稀释成浓度为20.0 mg/l的储备液。
葡萄样品购于保定三丰路农副产品批发市场。
2.2 色谱条件
kb5石英毛细管色谱柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm， 5%苯基二甲基聚硅氧烷柱）；进样口温度250 ℃；检测器温度290 ℃；柱温：采用程序升温，初始温度80 ℃，保持1.5 min，以29 ℃/min升至220 ℃，以3 ℃/min升至245 ℃保持0.5 min，再以35 ℃/min升至270 ℃；载气：高纯n2（≥99.999%），流速3.0 ml/min，尾吹气30 ml/min；进样模式：采用分流模式，分流比 1∶10，进样量为1.0 μl。
2.3 样品前处理
将葡萄样品在组织捣碎匀浆机中捣碎后称取20.0 g于20 ml的带塞离心试管中，加入5.0 ml 0.1 mol/l znac2溶液（防止杀菌剂分解）和20 μl 20.0 mg/l的内标液，振荡摇匀后以5000 r/min离心10 min，然后将上层清液转移至布氏漏斗中减压抽滤，将滤液在5000 r/min下离心10 min，上层清液转移至25 ml容量瓶中，用水定容，得到的葡萄样品溶液按２．４节中的实验方法进行萃取、测定。
2.4 分散液相微萃取的操作方法
移取5.0 ml葡萄样品溶液装在10 ml带塞的尖底离心试管中，加入1.0 ml丙酮（分散剂），振荡摇匀后以5000 r/min离心5 min，然后再将上层清液转移至另一离心试管中，加10.0 μl氯苯（萃取剂），轻轻振荡1 min，此时混合溶液形成水/丙酮/氯苯的乳浊液体系，氯苯均匀地分散在水相中，室温放置2.0 min，再以5000 r/min离心5 min，萃取剂氯苯沉积到试管底部，用微量进样器吸取1.0 μl萃取剂直接进样测定。
2.5 标准曲线的绘制
准确称取20.0 g已经匀浆的葡萄样品于20 ml的带塞离心试管中，加入适量20.0 mg/l百菌清、克菌丹和灭菌丹的混合标准溶液，其它按２．３节实验方法处理，得到浓度分别为10.0、30.0、50.0、70.0、100.0和150.0 μg/kg的系列混合标准溶液。每个样品按２．４节的实验方法萃取，直接进样分析。每个浓度平行测定5次，以分析物的峰面积与内标峰面积之比y对浓度x（μg/l）作标准曲线。
3 结果与讨论
本实验采用分散液相微萃取与气相色谱相结合测定葡萄样品中百菌清、克菌丹和灭菌丹3种杀菌剂。参照文献[12,13]，本方法的富集倍数和回收率的计算方法如下：用氯苯作溶剂分别配制3种杀菌剂的浓度均为0.5、1.0、2.0、3.0和5.0 mg/l的混合标准溶液，以峰面积对浓度作3种杀菌剂的标准曲线，根据测得的有机沉积相中分析物的峰面积求得各物质的浓度。富集倍数ｆ为有机相与水相中分析物的浓度之比。萃取回收率ｒ按下式计算：ｒ（％）＝ｃsedvsedc0veq×１００（１）ｖsed、vaq分别表示沉积到试管底部萃取剂的体积和水相的体积;csed、c０分别表示有机沉积相中分析物的浓度和水溶液中分析物的浓度。
为了达到最佳萃取效果，提高测定回收率，在待测物浓度为30.0 μg/kg的条件下对影响萃取效率的诸因素进行了优化。结果表明，在最优条件下， 3种杀菌剂的富集倍数可达788～876倍（见表1）。
3.1 萃取剂和萃取剂体积的选择
在分散液相微萃取中，萃取剂的选择是影响萃取效率的一个关键因素。所选萃取剂必须符合以下两个条件：一是密度大于水；二是不溶于水，且对被分析物的溶解能力大，以保证取得良好的萃取效率。本实验分别考察了氯苯（密度1.11 g/ml）、四氯化碳（密度1.59 g/ml）和溴苯（密度1.50 g/ml）对3种杀菌剂的萃取能力，结果表明，使用氯苯的萃取效率最好，故选择氯苯作为萃取剂。
萃取剂体积的选择直接影响本方法富集倍数的大小，考察了氯苯体积（7.0、10.0、12.0、15.0、20.0和30.0 μl）对萃取效率的影响，随着氯苯体积的增加，方法回收率变化不明显。但是，富集倍数却显著下降。其原因为氯苯体积增加使离心得到的有机相体积也随之增加，致使有机相中待测物的浓度降低，富集倍数减小，而且方法的灵敏度也随之降低。实验结果表明，当氯苯体积为10.0 μl时，离心后得到的有机相的体积为（3±0.4）μl，此时既可以保持较高富集倍数又能满足进样测定时所需的体积。所以氯苯体积选择10.0 μl。
3.2 分散剂和分散剂体积的选择
在本方法中分散剂的选择对“水/丙酮/氯苯的乳浊液体系”的形成起着关键作用，要求所选分散剂不仅能与水互溶而且可以与萃取剂互溶。合适的分散剂可以使萃取剂在水相中分散成细小的液滴，使溶液形成良好的“水/丙酮/氯苯的乳浊液体系”，增大萃取剂与待测物的接触面积。分别考察了丙酮、乙腈、甲醇和四氢呋喃作分散剂时的萃取效果。结果显示，使用丙酮时萃取效果最好，所以选用丙酮作为本实验的分散剂。
分散剂的体积直接影响“水/丙酮/氯苯乳浊液体系”的形成，它会通过影响萃取剂在水中的分散程度来影响萃取效率。考察了丙酮体积（0.5、1.0、1.5和2.0 ml）对萃取效率的影响。实验结果显示，萃取效率先随丙酮体积的增加而增加，在1.0 ml时达到最大值，而后又随丙酮体积的增加而减小。这是因为在丙酮体积小时，萃取剂不能均匀的分散在水相中，没有形成良好的水/丙酮/氯苯乳浊液体系，致使氯苯的萃取效率低；在丙酮体积较大时，待测物在水中的溶解度加大不易被氯苯萃取，萃取效率降低。所以选择分散剂丙酮体积为1.0 ml。
3.3 萃取时间的选择
在本方法中，萃取时间是指在水相中注入了氯苯后到混合液开始离心之前这段时间。分别考察了萃取时间为3.0,5.0,10.0,20.0,30.0和40.0 min时方法的萃取效率。实验结果显示，萃取时间对萃取效率没有显著地影响，因为在混合液形成乳浊液之后，氯苯被均匀的分散在了水相中与待测物接触面积大，待测物可以快速的由水相转移到有机相并且很快的达到两相平衡。本实验选取萃取时间为3.0 min。
3.4 盐浓度的影响
通过在水相中加入nacl（0～5%）的方法考察了盐浓度对萃取效率的影响。随着nacl浓度的增大，3种杀菌剂的回收率变化很小，但是富集倍数显著下降。这是由于离子强度的增加使有机萃取剂在水相中的溶解度减小，最后得到的有机沉积物的体积增加所造成的。所以本实验不加盐。
3.5 方法的线性范围、检出限和重现性
在最优的实验条件下，对系列浓度标准溶液进行萃取、测定，结果见表1。3种杀菌剂在10～150 μg/kg范围内均具有良好的线性关系。检出限在6．０～8．０ μg/kg之间，可满足实际样品的测定。
表1 3种杀菌剂的线性方程及其相关系数和方法的检出限（略）
table 1 reproducibilities, linearity and limits of detection (lods) the three fungicides
本方法中百菌清、克菌丹的检出限远低于国家标准所要求的葡萄中百菌清残留的最高限量（0.5 mg/kg）和水果中克菌丹残留的最高限量（15 mg/kg）[2]；3种杀菌剂的检出限也低于国家标准方法[18～20]所能达到的检出限，且均低于欧盟食品农药残留限量标准所要求的水果中克菌丹和灭菌丹的最高限量（低于3 mg/kg）和百菌清的最高限量（低于1.0 mg/kg）。对3种杀菌剂含量均为20、80和120 μg/kg的葡萄样品平行萃取测定5次，测定结果的rsd在4.6%～7.2%之间。
3.6 方法的回收率和样品测定
应用本方法分别测定了产自3个不同地区的葡萄样品，其中一个样品检测出有百菌清的残留，其残留量约为10.2 μg/kg（在国家要求的限量之内），样品的色谱图如图1所示。对没有杀菌剂残留的葡萄样品采用标准加入法平行测定5次，计算回收率和相对标准偏差，结果见表2。葡萄加标样品中3种杀菌剂的典型色谱图如图2所示。3种杀菌剂的加标回收率在92.3%～106.1%之间；相对标准偏差（rsd）小于7.2%，本方法的回收率和重现性均令人满意。
表2 葡萄样品中杀菌剂的测定结果和加标回收率（略）
table 2 ｄeterminations result of fungicides residues in grapes and recoveries of spiked grape samples
nd：未检出（no detected）。
4 结论
本实验建立了分散液相微萃取气相色谱联用快速、灵敏地分析葡萄样品中3种杀菌剂残留的新方法。实验结果表明，与传统的萃取方法相比，本方法具有操作简单、快速、准确、低成本、环境友好和富集倍数高等优点。目前分散液液微萃取（dllme）技术还主要用于水样中痕量成分的测定，本实验的结果表明，该技术用于复杂基质的果蔬样品的测定也可取得满意的结果，这对于拓宽分散液相微萃取技术的应用范围具有指导意义。
图1 葡萄的色谱图（略）
fig.1 ｃhromatogram of grape sample
1. α六六六（αbenzene hexachloride）； 2. 百菌清（chlorothalonil）。
图2 3种杀菌剂的标准色谱图 （略）
fig.2 ｔypical chromatogram of grape sample spiked with each fungicide at 30.0 μg/kg
1. α六六六（αbenzene hexachloride）； 2. 百菌清（chlorothalonil）； 3. 克菌丹（captan）； 4. 灭菌丹（folpet）。
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