【摘要】 利用高效液相色谱分离、电喷雾-线性离子阱质谱法（lc-esi/ltq）、电喷雾-离子阱/飞行时间串联质谱法（lc-esi/it-tof）鉴定鸡血浆中乙酰甲喹及其代谢物的结构。分别采用hypersil gold和symmetry shieldtm 色谱柱，以含有0.01%甲酸水溶液（a）和甲醇（b）为流动相，梯度洗脱，电喷雾离子源（esi）正离子模式进行检测。鸡口服给药乙酰甲喹（20 mg/kg）后，翅下静脉采血，待分析血浆用乙腈-乙酸乙酯（3∶2，v/v）混合液提取，吹干。残渣用30%甲醇水溶液复溶，上机检测。用 shimadzu’s composition 分子预测软件推测分子离子及其子离子质量，xcalibur 2.0.7 软件分析线性离子阱质谱仪测得质谱图。鉴定出5种主要代谢物，分别为 3-甲基-2-（1-羟基）乙基-喹啉-1，n4-二氧化物（m1）、3-甲基-2-（1-羟基）乙基-喹啉-n4-一氧化物（m2）、3-甲基-2-乙酰基-喹啉-n4-一氧化物 （m3）、3-甲基-2-乙酰基-喹啉 （m4）和3-羟甲基-2-（1-羟基）乙基-喹啉-n1，n4-二氧化物 （m5）。同时根据推测结果对代谢物m1~m4进行化学合成，利用合成代谢物的谱学测定数据进一步确证推测代谢物的化学结构。本实验为研究乙酰甲喹体内代谢产物及代谢机理提供了便捷而有效的模式。
【关键词】 乙酰甲喹; 代谢物; 高效液相色谱-电喷雾电离离子阱飞行时间串联质谱; 结构鉴定
identification of mequindox and its metabolites by high performance liquid chromatography combined with ion trap-time of flight-mass spectrometryliu ying-chun，si hong-bin，he li-min，ding huan-zhong，huang xian-hui，chen jian-xin，chen zhang-liu，zeng zhen-ling* (guangdong provincial key laboratory of veterinary pharmaceutics development and safety evaluation，college of veterinary medicine，south china agricultural university，guangzhou 510642)abstract the chemical structures of mequindox related metabolites in chicken plasma had been investigated using high performance liquid chromatography combined with linear ion trap quadrupole(lc-esi/ltq) and high performance liquid chromatography combined with ion trap-time of flight-mass spectrometry(lc-esi/it-tof).samples were separated by hypersil bds c18 and symmetry shieldtm columns，respectively，and 0.01% formic acid aqueous(a) and methanol(b) were used as mobile phase with gradient elution.electrospray ionization mass spectrometric(esi) source was used and operated in positive ion mode.when chickens were orally administered with mequindox at dosage of 20 mg/kg，blood samples were collected from the brachial vein.mequindox and its metabolites were extracted by the mixture of acetonitrile and acetoacetate(3∶2， ｖ/ｖ).after solvent evaporated，the residue was dissolved in 30% methanol aqueous and the solution was detected by lc/it-tof ms and lc-esi/ltq.the molecule weight from lc-esi/it-tof was analyzed by software shimadzu’s composition and the mass chromatogram from lc-esi/ltq was analyzed by software xcalibur 2.0.7.according to the molecular weight and msn data，referring the metabolic reaction rules，five chemical structures of mequindox related metabolites in chicken plasma were identified.metabolites(m1-m4) were synthesized to verify the structure of metabolites.the metabolites are 3-methyl-2-(1-hydroxy)ethyl-quinoxaline-n1，n4-dioxide(m1)，3-methyl-2-(1-hydroxy) ethyl-quinoxaline-n4-oxide(m2)，3-methyl-2-acetyl-quinoxaline-n4-oxide，3-methyl-2-acetyl-quinoxaline(m4)，3-hydroxymethyl-2-(1-hydroxy)ethyl-quinoxaline-n1，n4-dioxide(m5).
keywords mequindox; metabolites; high performance liquid chromatography; ion trap-time-of flight-mass spectrometry; structure identification
1 引言
乙酰甲喹(mequindox)，又名痢菌净，化学名为 3-甲基-2-乙酰基-喹啉-n1，n4-二氧化物，为卡巴氧类似物，是由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所合成的兽用药〖1〗橇现幸阴＜奏康牟舛ǎ阴＜奏谥砑∪庵械募觳夥椒í‐〖6〗诿嘌颉⒓彝锰迥谝┪锎欢ρи‐〖7，8〗以及乙酰甲喹与血清白蛋白的结合〖9〗等方面，对于动物给药乙酰甲喹后在其体内代谢产物的识别和鉴定鲜有报道。Www.11665.cOm鉴此，本实验室采用高效液相色谱串联线性离子阱质谱、高效液相色谱串联离子阱飞行时间高分辨质谱等技术，对鸡口服给药乙酰甲喹后的代谢物进行分离鉴定，同时借鉴喹乙醇、卡巴氧、喹赛多、喹烯酮等同类化合物的代谢规律及其检测方法〖10~16〗撇庖阴＜奏晃锏目赡芙峁梗⑼üш铣山徊窖橹ち擞泄卮晃锝峁埂
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
高效液相色谱串联离子阱飞行时间质谱仪（日本岛津公司），包括高效液相色谱系统，lc-20ad流动相输送泵，sil-20ac自动进样器，dgu-20a3脱气装置，spd-m20a二极管检测器，cbm-20a信号处理系统，cto-20ac柱式加热器；高效液相色谱-电喷雾-线性离子阱质谱，配survey液相操作系统（美国thermo fisher scientific 公司）；高效液相色谱仪（美国戴安公司）；bruker avance 400型超导核磁仪（瑞典bruker公司），tms为内标。乙酰甲喹（含量99.5%，批号20060801，江苏天成动物保健品有限公司）；代谢物m1， m2， m3， m4对照品（广东省兽药研制与安全评价重点实验室合成）；甲醇（色谱纯，sigma公司）；乙酸乙酯、乙腈（分析纯，国药集团上海化学试剂厂)。
2.2 色谱质谱条件
2.2.1 高效液相色谱条件 hypersil bds c18色谱柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）， 柱温： 30 ℃； 流动相： 甲醇（b）/水(含0.01%甲酸)（a）， 梯度洗脱： 0～40 min， 20%～35% b； 40～45 min， 35%～60% b； 45～57 min， 60% b； 57～60 min， 60%～20% b； 60～65 min， 20% b。 流速1 ml/min， 检测波长241 nm。
2.2.2 高效液相色谱-电喷雾-线性离子阱质谱（lc-esi-ltq ms）条件 hypersil gold c18色谱柱（100 mm×2.1 mm， 5 μm）， 柱 温：40 ℃；流动相：甲醇（b）/水(含0.01%甲酸)，梯度洗脱：0～7 min，10%～40% b；7～10 min，40%～90% b； 10～12 min，90% b ；12～13 min，90%～10% b；13～18 min，10% b。流速：0.25 ml/min。
电喷雾离子化源，正离子模式检测，检测电压：4.5 kv；毛细管电压：5.0 v；管透镜电压：85.0 v；鞘气（n2）：流速40个单位；辅气（n2）：5.0个单位；多级质谱相对碰撞能量：35%；扫描范围：m/z 100～500。
2.2.3 高效液相色谱-电喷雾-离子阱/飞行时间串联质谱(lc-esi-it/tof ms)条件 symmetry shieldtm色谱柱（50 mm×2.1 mm， 3.5 μm）；柱 温： 40 ℃； 流动相： 甲醇（b）/水(含0.01%甲酸)， 梯度洗脱同方法2.2.2； 流速： 0.2 ml/min。 电喷雾离子化源， 正离子模式检测， 检测电压： 1.6 kv； 雾化气流速： 1.5 l/min； 干燥气流速：4.0 l/min； tof 真空度： 1.5×10－4 pa； it真空度： 1.7×10－2 pa； 诱导解离碰撞时间： 30 ms； 多级 ms碰撞能量： 50%； 精确质量数用三氟醋酸钠校准； 干燥气温度： 35 ℃， 干燥气流速： 10 l/min， 毛细管电压： 4 kv， 裂解电压： 100 v； 扫描范围： m/z 150～400。
2.3 样品采集与处理
实验动物为科宝-500白羽鸡（正大康地（东莞）有限公司），饲养至4周龄，2.0～2.5 ㎏，实验前鸡拒食12 h，正常饮水，口服灌药20 mg/kg体重。给药后分别于 0，10，15，30，45 min和1，2，4，6，8，10 h采血，每次 2 ml，于加有抗凝剂离心管内并离心，血浆样品－20 ℃保存，待测。用微量移液枪量取血浆样品1 ml于15 ml离心管内，加6 ml乙腈-乙酸乙酯（3∶2，v/v）混合液漩涡、震荡30 min，6000 r/min离心10 min，取有机相于另一离心管，重复提取，合并有机相，于45 ℃下氮气吹干，加1 ml 30%甲醇水溶液溶解，离心后取上清液过0.22 μm滤膜，上机检测。
3 结果和讨论
3.1 合成代谢物谱学测定结果
乙酰甲喹及体内推测代谢物（m1~m5）结构如图 1所示。对化学合成代谢物（m1~m4）分别进行1h-nmr、13c-nmr及lc-esi/ltq-ms质谱解析。
（１）代谢物ｍ１ 1h-nmr(400 m，cd3od)：δ 8.55(2h，m，5，8-h)，δ 7.93(2h，m，6，7-h)，δ 5.83(1h，q，j=4.4 hz 11-h)，δ 2.82(3h，s，13-h)，δ 1.62(3h，d，j=5.2 hz，12-h)，13c-nmr(100 m，cd3od)：δ 148.37(2-c)，δ 144.04(3-c)，δ 137.98(9-c)，δ 137.89(10-c)，δ 133.18(8-c)，δ 132.86(5-c)，δ 120.89(7-c)，δ 120.71(6-c)，δ 65.99(11-c)，δ 19.75(13-c)，δ 14.29(12-c)；esi-ms：m/z 221 〖m+h〗+。
（２）代谢物ｍ２ 1h-nmr(400 m，cd3od)：δ 8.58(1h，m，8-h)，δ 8.08(1h，m，5-h)，δ 7.79(1h，m，7-h)，δ 7.73(1h，m，6-h)，δ 5.14(1h，q，j=4.4 hz 11-h)，δ 2.65(3h，s，13-h)，δ 1.53(3h，d，j=4.0 hz，12-h)；esi-ms：m/z 205 〖m+h〗+。
（３）代谢物ｍ３ 1h-nmr(400 m，cd3od)：δ 8.52(1h，m，8-h)，δ 8.17(1h，m，5-h)，δ 7.90(2h，m，6，7-h)，δ 2.76(6h，s，12，13-h);13c-nmr(100 m，cd3od)：δ 13.95(13-c)，δ 27.93(12-c)，δ 119.55(3-c)，δ 131.78(6-c)，δ 132.56(7-c)，δ 133.45(5-c)，δ 137.93(8-c)，δ 141.84(10-c)，δ 143.20(9-c)，δ 152.03(2-c)，δ 201.22(11-c); esi-ms：m/z 203 〖m+h〗+。
（４）代谢物ｍ４ 1h-nmr(400 m，cd3od)：δ 8.12(1h，dd，j=5.2 hz，j=0.8 hz，8-h)，δ 7.99(1h，dd，j=5.2 hz，j=0.8 hz，5-h)，δ 7.88(1h，m，7-h)，δ 7.81(1h，m，6-h)，δ 2.89(3h，s，12-h)，δ 2.78(3h，s，13-h);13c-nmr(100 m，cd3od)：δ 24.23(13-c)，27.67(12-c)，δ 128.95(6-c)，δ 130.85(7-c)，δ 131.06(5-c)，δ 133.39(8-c)，δ 141.09(9-c)，δ 143.45(10-c)，δ 148.98(3-c)，δ 154.28(2-c)，δ 202.41(11-c); esi-ms：m/z 187 〖m+h〗+。
图1 乙酰甲喹及其可能代谢物结构（略）
fig.1 mequindox and its proposed metabolites
3.2 乙酰甲喹电喷雾-离子阱/飞行时间质谱联用及线性离子阱质谱分析
从电喷雾-离子阱/飞行时间质谱检测结果分析， 乙酰甲喹的一级质谱以准分子离子峰 m/z 219.0772 〖m+h〗+为基峰，其主要碎片离子分别为m/z 185.0721，160.0640，143.0608（表１）。乙酰甲喹准分子离子m/z 219.0772失去h2o2产生碎片m/z 185（m+h－h2o2），失去c2h3o2产生碎片m/z 160（m+h－c2h3o2）。三级碎片离子m/z 116和102分别由碎片m/z 143失去hcn和ch3cn产生，该二碎片离子质量相对误差偏大可能是它们质量较小，且信号相对强度较低等因素造成，但绝对误差（m/z 116， 102分别为－2.7和－4.7 mda）均在允许范围内。在用电喷雾-线性离子阱质谱检测条件下同样出现碎片离子m/z 160和143，还获得了脱一氧形成的m/z 202（m+h+－oh）自由基碎片离子。
3.3 鸡血浆中乙酰甲喹及其代谢物的鉴定
鸡口服给药6 h后，在其血浆中未检测到原药。与空白血浆相比代谢物质子化的分子离子〖m+h〗+分别为m/z 221.0934，205.0987，203.0824，187.0877和237.0874。对这些组分分别进行 lc-ms2分析，得到各个组分的lc-ms2色谱及质谱图，各代谢物保留时间、预测分子式、实测分子量、预测分子量、观测值与实测值分子量之间相对误差及主要碎片离子见表2。图 2为化学合成代谢物m1， m2， m3， m4与给药血浆及空白血浆hplc对照图，合成代谢物与体内推测可能代谢物均具有相同的保留时间。
表1 乙酰甲喹及其主要碎片离子预测分子式、准分子离子分子量、预测分子量理论值及相对误差（略）
table 1 formulas，observed masses，predicated masses，and mass error of the fragment ions of protonated mequindox
从表2可知，代谢物 m1 〖m+h〗+（m/z 221）子离子 m/z 203， 161和144均比原型药乙酰甲喹〖m+h〗+（m/z 219）子离子m/z 202， 160， 143多1 da，表明代谢物m1为乙酰甲喹的还原产物，即3-甲基-2-（1-羟基）乙基-喹啉-n1，n4-二氧化物，根据推测代谢物m1结构对其进行化学合成，化学合成代谢物 m1与血浆中推测代谢物m1两者具有相同的碎片离子m/z 203， 187， 161和144。图 2为合成代谢物m1与给药血浆hplc图谱，两者重合性良好，说明化学合成代谢物m1很好的验证了体内推测代谢物m1的结构。
代谢物m2 〖m+h〗+（m/z 205）及其子离子m/z 187均比m/z 221及其子离子m/z 203少 16 da，可推断代谢物m2为代谢物m1的去氧代谢产物。4位n→o基团还原由于受邻近甲基影响，氧原子不易被脱去〖16〗
酝撇馄渲饕晃镂-甲基-2-（1-羟基）乙基-喹啉-n4-一氧化物。根据推测代谢物m2结构对其进行化学合成，与体内代谢物进行比较，二者具有相同的碎片离子m/z 187和170。图2为合成代谢物m2与给药血浆hplc图谱，两者重合性良好，说明化学合成代谢物m2很好地验证了体内推测代谢物m2的结构。
表2 乙酰甲喹及其代谢物保留时间及碎片离子高效液相色谱串联质谱分析结果（略）
table 2 lc/ms retention times(rt) and fragment ions of mequindox and its related metabolites
图2 合成代谢物对照品及血浆中乙酰甲喹代谢物hplc图 （略）
fig.2 high performance liquid chromatogram of metabolite reference substances and metabolites in plasma
1． 代谢物m4对照品（reference substance of metabolite m4）； 2． 代谢物m2对照品（reference substance of metabolite m2）； 3． 代谢物m1对照品（reference substance of metabolite m1）； 4． 代谢物m3对照品（reference substance of metabolite m3）； 5． 空白血浆（ｂlank plasma）；(6) 给药血浆（ｓample plasma after administration）。
代谢物m3 〖m+h〗+（m/z 203）及其碎片离子m/z 186均比乙酰甲喹 〖m+h〗+（m/z 219）及其碎片离子202少16 da，推断其为原药的脱一氧代谢产物，4位n→o基团还原由于受邻近甲基影响，氧原子不易被脱去〖16〗
酝撇馄渲饕晃镂3-甲基-2-乙基-喹啉-n4-一氧化物。根据推测结构对其进行化学合成，比较代谢物m3对照品与血浆提取代谢物m3二级质谱图，两者具有相同的碎片离子m/z 186，161，144。图 2为合成代谢物m3与给药血浆hplc图谱，两者保留时间相同说明化学合成代谢物m3很好的验证了体内推测代谢物m3的结构。
代谢物m4〖m+h〗+（m/z 187）比原药〖m+h〗+少32 da，推断代谢物m4为乙酰甲喹的脱二氧代谢产物。根据推测结构对其进行化学合成，代谢物m4对照品二级质谱图与血浆提取代谢物m4二级质谱图具有相同的碎片离子m/z 169和159。但是由于其含量较少，色谱图信号较弱，几乎观测不到代谢物m4色谱峰，其岀峰位子如图2。 代谢物m5〖m+h〗+（m/z 237）及其子离子m/z 219，203均比代谢物m1〖m+h〗+（m/z 221）及其相应子离子m/z 203，187多16 da，代谢物m5的保留时间小于代谢物m1，说明m5的极性大于m1（表2）；m5子离子m/z 203的三级质谱中出现m/z 185，m/z 185由m/z 203失去h2o得到，推测3位甲基带有一羟基即3-羟甲基-2-（1-羟基）乙基-喹啉-n1，n4-二氧化物。
【参考文献】
1 liang jian-ping（梁剑平），wei zeng-quan（卫增泉），zhang li（张 力），zhou li-xia（周丽霞），zhou xue-hui（周学挥），li wen-jian（李文建），zhou guang-ming（周光明）.acta agriculturae nucleatae sinica(核农学报)， 2000， 14（3）：151～156
2 guo xiao-qing（郭小清），tang li-ping（唐莉苹），nie jian-chao（聂建超），zou xue-gang（邹学刚），du hai（杜 海），zhou long-li（周龙莉）.chinese journal of troditional veterinary science(中兽医学杂志)，2005，3：6～8
3 li jin-quan（李锦泉），zhao wu（赵 武），xu li-gan （许力干），huang jun （黄 峻），liao yan-qing （廖彦卿）.animal husbandry & veterinary medicine(畜牧与兽医)，2002，134（14）：62
4 sun zhan-he（孙展和）.poultry husbandry and disease control（养禽与禽病防治），2005，8：37
5 lin lin（林 林）.animal husbandry & veterinary medicine（畜牧与兽医），2000： 5
6 zhang jia-hui（张嘉慧），he li-min（贺利民），huang xian-hui（黄显会），zeng zhen-ling（曾振灵）.journal of south china agricultural university(华南农业大学学报)，2008，29（4）：320～323
7 huang yong-qi（黄勇旗），li yin-qian（李引乾），yang ya-jun（杨亚军），miao xiao-lou（苗小楼），xie yun（谢 云），bai dong-ying（白东英），lu chen-wei（陆晨薇），sun li（孙 黎），ma bao-zhen（马宝祯）.journal of northwest a & f university(nat .sci.ed.)（西北农林科技大学学报（自然科版）），2008，36(2)：77～81
8 lu chen-wei（陆晨薇），li yin-qian（李引乾），guan yong-juan（关永娟），zhang yi-bo（张煜波），bai dong-ying（白东英），miao xiao-lou（苗小楼），xiong yong-jie（熊永洁）.journal of northwest a & f university(nat.sci.ed.) （西北农林科技大学学报（自然科版）），2008，36（12）：29～34
9 zeng zhou-hua（曾舟华），liu yi（刘 义），hu xian-ming（胡先明），xu zhen-qiang（徐振强），zeng kun（曾 昆).chinese j.chem.（中国化学），2009，27（４）：681～686
10 boison j o，lee s c，gedir r g.anal． chim． acta，2009，637（１-２）：128～134
11 kesiunaite g，naujalis e，padarauskasa a.j.chromatogr.a，2008，1209（１-２）：83～87
12 hutchinson m j，young p b，kennedy d g.j.chromatogr.b，2005，816：15～20
13 huang l l，wang y l，tao y f，chen d m，yuan z h.j.chromatogr.b，2008，874（１-２）：7～14
14 huang l，xiao a，fan s.j.aoac int.，2005，88(2)：472～478
