【摘要】  建立了黄酒中5-羟甲基糠醛和9种多酚（儿茶素、表儿茶素、绿原酸、芦丁、咖啡酸、原儿茶酸、丁香酸、阿魏酸、p-香豆酸）的高效液相色谱检测方法。采用diamonsil c18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）分离，柱温为42 ℃，检测波长为280 nm，流动相为乙腈和3%乙酸水溶液，梯度洗脱，20 min内10种物质得到了较好的分离。各化合物回归方程的相关系数r为0.9911～0.9995，检出限为0.2～0.5 mg/l； 相对标准偏差rsd≤2.4 %； 10种组分的平均回收率为89.4%～98.3%； 能够满足定量分析要求。实验结果表明，本方法适用于不同种类和年份黄酒中5-羟甲基糠醛和9种多酚的检测。

【关键词】  糠醛；多酚；反相高效液相色谱；黄酒

            simultaneous determination of 5-hydroxymethylfurfural　and nine kinds of phenolic compounds in rice wine　using high performance liquid chromatographychen lei，huang xue-song*(department of food science and engineering，jinan university，guangzhou 510632)abstract  an analytical method of reversed phase high performance liquid chromatography (rp-hplc) was developed for simultaneous determination of 5-hydroxymethylfurfural and nine phenolic compounds(including (+)-catechin，(－)-epicatechin，chlorogenic acid，rutin，caffeic acid，protocatechuic acid，syringic acid，ferulic acid and p-coumaric acid) in 20 min.ten components were detected and separated successfully by diamonsil c18 column (150 mm×4.6 mm，5 μm) at wavelength of 280 nm and column temperature of 42 ℃，with acetonitrile and 3% acetic acid solution as the mobile phase in gradient elution.the resultant correlation coefficients of the ten compounds were between 0.9911 and 0.9995 with detection limit from 0.2 to 0.5 mg/l，the rsd less than 2.4% and the average recoveries from 89.4% to 98.3%.these experimental results demonstrate that 5-hydroxymethylfurfural and the nine phenolic compounds in different rice wine samples can be determined with the new method for practical uses.

　　keywords  hydroxymethylfurfural；polyphenol；reversed phase high performance liquid chromatography；rice wine

　　1  引言

　　黄酒（rice wine）是我国的特产，历史悠久，含有丰富的营养素与多种活性物质，具有饮用、调味、药用、保健等作用。wwW.11665.cOm黄酒的这些作用与其所含有的化学成分（如糊精、有机酸、氨基酸、活性肽、维生素、多酚、微量芳香成分等）密切相关［1，２］。其中，多酚是黄酒调味、药用、保健等作用的基础物质，但黄酒中的多酚常难以准确测定。5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，hmf）作为一种maillard反应的重要产物，不仅是引起食品风味和褐变的指标成分，而且具有多方面的生理作用 ［3～5］，受到广泛关注。因此，检测农产品及其加工食品中的多酚和hmf，对于正确评价食品原料及其制品的保健作用和品质具有重要意义。

　　目前，高效液相色谱检测单体多酚类物质已有很多报道，但主要集中于检测酚酸类与黄酮类物质方面［6～１1］。由于两类多酚的性质差异较大，难以同时测定。若在变波长条件下同时检测hmf和多酚，则需要二极管阵列检测器，而且耗时长［１2］。将hmf与多酚类物质以高效液相色谱法同时检测还未见报道。本研究采用反相高效液相色谱（rp-hplc）同时检测黄酒中hmf和上述两类多酚中9种常见的代表性酚类物质，并测定不同品牌不同年份的黄酒样品中多酚和hmf的含量，为不同年份的酒质提供评价依据。

　　２  实验部分

　　２．１  仪器、原料与试剂

　　lc-20at高效液相色谱仪，配备spd-m20a光电二极管阵列检测器（dad，日本岛津公司）；diamonsil c18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，美国迪马公司）；sz-97自动三重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；溶剂过滤器和0.45 μm微孔滤膜（天津津腾试验设备有限公司）。

　　黄酒：从浙江各公司购得目前市场销售量大的两个品牌（分别记为品牌i、品牌ii）3年陈、5年陈、8年陈、10年陈酒样，用于测定其hmf和多酚的含量。

　　(＋)-儿茶素、(－)-表儿茶素（上海同田生化技术有限公司）；阿魏酸（中国医药（集团）上海化学试剂公司）；绿原酸（中国药品生物制品鉴定所）；5-羟甲基糠醛、芦丁、咖啡酸、原儿茶酸、丁香酸、p-香豆酸（sigma公司）； 乙腈（hplc级，美国dikma公司）； 冰乙酸（分析纯，天津市化学试剂一厂）。实验用水为二次蒸馏水。

　　２．２  色谱条件

　　diamonsil c18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；检测温度：42 ℃；检测波长：280 nm；进样量：10 μl；流动相：乙腈，3%乙酸水溶液，梯度洗脱程序见表1。

　　表1  hplc梯度洗脱程序（略）

　　table 1  ｇradient eluted program of hplc

　　２．３  标准溶液及样品溶液的配制

　　准确称取标准品5-羟甲基糠醛、(+)-儿茶素、(－)-表儿茶素、芦丁、咖啡酸、阿魏酸、原儿茶酸、绿原酸、丁香酸、p-香豆酸各约10.0 mg，分别用乙腈定容至10 ml，得到每个标准品的标准溶液。分别移取1.0 ml hmf、阿魏酸、丁香酸、p-香豆酸标准溶液和2.0 ml(+)-儿茶素、(－)-表儿茶素、芦丁、原儿茶酸、咖啡酸、绿原酸标准溶液，用流动相（v(3%乙酸水溶液)∶v(乙腈)=8∶2）定容至50 ml，得多酚混合标准贮备液，使用时用流动相稀释成不同浓度梯度的标准溶液。

　　取不同品牌各年份的黄酒用0.45 μm微孔滤膜过滤，供hplc检测。

　　２．４  分析方法的评价

　　２．４．１  标准曲线  准确移取混合标准溶液各0.5， 1.0， 2.0， 4.0和8.0 ml，分别定容至10 ml，每个浓度重复进样3次，以各单体酚的平均峰面积与标准溶液中物质的含量作校准曲线，并计算相关系数。

　　２．４．２  检出限和精密度的测定  将一定质量浓度的标准溶液逐级稀释，进样。当信噪比等于3时，所对应的标准溶液中所含组分的质量为检出限。将某一浓度的标准溶液重复进样5次，根据结果计算相对标准偏差。
   
　　３  结果与讨论

　　３．１  检测波长的确定

　　通过二极管阵列检测器（dad）扫描得到各物质在紫外光区的最大吸收波长（图1），为了能同时测定这几种物质，同时又避开溶剂的吸收，检测波长确定为280 nm。

　　图1  10种物质的紫外光谱图（略）

　　fig.1  ultraviolet spectrogram of 10 components

　　a.5-羟甲基糠醛(5-ｈydroxymethylfurfural，hmf)；b.原儿茶酸(ｐrotocatechuic acid)；c.(+)-儿茶素((+)-ｃatechin)；d.绿原酸(ｃhlorogenic acid)；e.咖啡酸(ｃaffeic acid)；f.（－）-表儿茶素 (（－）-ｅpicatechin)；g.丁香酸(ｓyringic acid)；h.p-香豆酸(p-ｃoumaric acid)；i.芦丁 (ｒutin)； j.阿魏酸(ｆerulic acid)。

　　３．２  色谱条件的优化

　　3.2.1  流动相及洗脱比例和流速  考察了0.5%乙酸水溶液-乙腈、2%乙酸水溶液-乙腈和3%乙酸水溶液-乙腈作流动相时的分离效果。结果显示，随乙酸含量的增加，峰形和分离效果变好。考虑到ph太低会损坏色谱柱而导致柱效降低，而且会使基线严重漂移，故选定3%乙酸溶液和乙腈为流动相。通过调整流动相的比例发现，使用线性梯度洗脱时，峰形和分离度都无法达到要求。同时，对比了多种流速效果后，为了缩短分析时间同时获得比较理想的分离效果，最终选定在不同洗脱比例下使用不同流速。
 
　　图2  最优分离色谱图（略）

　　fig.2  chromatogram of optimized separation

　　1.5-羟甲基糠醛(5-ｈydroxymethylfurfural)；2.原儿茶酸(ｐrotocatechuic acid)；3.(+)-儿茶素 ((+)-ｃatechin)；4.绿原酸(ｃhlorogenic acid)；5.咖啡酸(ｃaffeic acid)；6.(－)-表儿茶素 ((－)-ｅpicatechin)；7.丁香酸(ｓyringic acid)；8.p-香豆酸(p-coumaric acid)；9.芦丁(ｒutin)；10.阿魏酸(ｆerulic acid)。

　　3.2.2  进样量的选择  通过比较进样量分别为5，10和20 μl的分离效果发现，当进样量过大时，色谱峰会出现拖尾峰或者前延峰，而且分离效果不佳。如果进样量太少，吸收少，有时会检测不到。最终选定进样量为10 μl。

　　3.2.3  色谱条件的确定  由以上实验，最终确定分离hmf和多酚类物质的色谱条件是：检测波长280 nm，柱温42 ℃，进样量为10 μl， 3%乙酸水溶液与乙腈梯度洗脱（表1）。在此色谱条件下进样，得到多酚的标准色谱图（图2）。

　　由图2可见， 10种物质得到了很好地分离，而且分离时间只有20 min。与已报道的方法［10，１3］相比，分离时间及分离效果都得到了明显改善。

　　３．３  分析方法的评价

　　在已确定的色谱条件下，分别对不同浓度的标准溶液进样分析，根据平均峰面积与标准物质的含量关系进行线性回归，同时测得检出限(表2)。

　　表2  10种物质的回归方程、检测限和相对标准偏差(n=5)（略）

　　table 2  regression equations ，detection limits and relative standard deviations of 10 compounds(n=5)

　　在各相应的线性范围内，相关系数r均大于0.99，表明线性关系良好，而且精密度高（相对标准偏差为1.2%～2.4%），能满足定量分析的要求。

　　３．４  样品的测定及回收率的检测

　　取3年陈的品牌i酒样，加入适量混合标准品溶液，混合均匀后，按“2.2”节色谱条件测定加标回收率，由表3可见，样品各组分的加标回收率为89.4%～98.3%； rsd为2.6%～5.3%。

　　在2.2所述条件下，分别将两品牌4个不同陈化年份的酒样滤后进样，测定其中各物质的含量（图3，表4）。

　　表3  10种物质的回收率(n=3)（略）

　　table 3  recoveries of 10 components by hplc analysis(n=3)

　　图3  黄酒样品中多酚的色谱图（略）

　　fig.3  chromatogram of hmf and phenolic compounds in different rice wines

　　峰号同图2（peak numbers are same as in fig.2）.

　　表4  各黄酒样品中10种物质的含量测定结果(n=3)（略）

　　table 4  determination results of 10 components in different rice wine samples(n=3)

　　“－”未检出（not detected）。
   
　　由表4可以看出，黄酒中hmf含量随时间延长而增加。这是因为在黄酒陈化过程中一直进行maillard反应所致。但是8年陈黄酒中hmf含量要高于10年陈，这可能由于陈化到一定时间后maillard反应第3阶段占优势，hmf与其它物质交联导致含量降低［１４］；大部分多酚含量随陈化时间增长而下降，这可能由于陈化过程中多酚与蛋白交联产生沉淀而导致含量降低，这表明陈化时间越长的黄酒中多酚等活性成分含量越低，从营养保健的角度讲，并非越陈越好；有些多酚随陈化时间延长而含量增加，是因为其样品并非为同一批原料酿造而存在一定范围内的差异。

【参考文献】
  1 wang jian-guo(汪建国).china brewing(中国酿造)， 2004，(4)：6～10

　　2 xie guang-fa(谢广发).liquor making(酿酒)，2008，35(5)：14～16

　　3 fallico b，zappala e，arena m.j.food sci.， 2008， 73(9)：c625～c631

　　4 delgado-andrade c，seiquer i，navarro m p，morales f j.food chem.toxicol.， 2008，46(5)：1600～1607
　
　　5 durling l j k，busk l，hellman b e.food chem.toxicol.， 2009，47(4)：880～884

　　6 janzowski c，glaab v，samimi e，schlatter j，eisenbrand g.food chem.toxicol.， 2000，38(9)：801～809

　　7 zhang ang(张 昂)，fang yu-lin(房玉林)，wang hua(王 华)，song jian-qiang(宋建强)，zhang yu-lin(张予林)，song shi-ren(宋士任).chinese j.anal.chem.(分析化学)， 2007，35(11)：1614～1618

　　8 wan zheng-min(万政敏)，hao yan-bin(郝艳宾)，yang chun-mei(杨春梅)，qi jian-xun(齐建勋)，zhao li-qin(赵丽芹)，wang ke-jian(王克建).science and technology of food industry(食品工业科技)， 2007，28(7)：212～213