作者：唐松山，唐治华，李红枝，游娟
【摘要】 目的 测定agacutin两个相近亚基的n端15个氨基酸残基序列，酶分子的2个亚基需拆分以获得亚基单肽链并测序。方法 通过生物化学方法获得高纯化agacutin，经sds-page电泳分离、亚基胶条回收及pvdf膜电转移技术等方法制备了可供鉴定和测序的单亚基样品，后者通过edman降解法，测定了亚基n端15个氨基酸残基序列。结果 大亚基(16 kda)的序列为：dcssgwssyeehqyy，小亚基(15 kda)序列为dssgwssyegheyyv。结论 测序结果经ncbi 数据库检索发现，agacutin为新的蛇毒类凝血酶。
【关键词】 尖吻蝮蛇蛇毒; 类凝血酶; 亚基拆分; 蛋白n端测序
abstract:objective to sequence nterminuses of the close two subunits of agacutin,the separation of single subunit was completed for the sequencing.methods the single subunits of agacutin were obtained by using sdspage,subunit gel recovery and electrical transfer technique. the edman degradation method was used for the sequencing.results the subunit sequences of the 16 and 15 kda were determined to be dcssgwssyeehqyy and dssgwssyegheyyv,respectively.conclusion according to above sequencing results,the ncbi blast comparison showed that agacutin is a novel thrombinlike enzyme.
key words:agkistrodon acutus snake venom; thrombinlike enzyme; subunit separation; protein nterminal sequencing.
蛇毒含有许多特殊蛋白酶和活性多肽,这些酶可能作为支持物质参与消化，并且也是蛇毒神经毒和出血毒的主要原因。wWW.11665.cOm自1995年以来，一系列对血液凝固系统起作用的结构和功能多样性的酶自尖吻蝮蛇蛇毒中被纯化。1995年,chen yl等[1]纯化了agkicetin(14和15 kda的异二聚体)，它具有gp1b拮抗剂和血小板抑制活性;1998年,yeh ch等[2]纯化了accutin(5.241 kda)，一个新的整合素成员，它潜在性地抑制血小板聚集;1999年，huang qq等[3]报道了类凝血酶acuthrombina(28 kda)和acuthrombinc(69 kda);cheng x等[4]纯化了纤维蛋白溶解酶agkisacutacin(14和15 kda的异二聚体);pan h等[5]成功克隆了acutin(38 kda)，一个具有去纤化功能的类凝血酶;2000年，xu xl等[6]报道了2个抗凝血类凝血酶acfi (anticoagulation factori)和acfⅱ(anticoagulation factorⅱ)(14.6和14.7 kda的异二聚体);2001年,yeh ch等[7]报道了血小板糖蛋白ib拮抗剂agkistin(16.5和15.5 kda的异二聚体)和liang xx等[8]报道了纤溶酶fⅱ(a)(26 kda);2003年，郑颖等[9]纯化了2个类凝血酶;2004年,李婷等[10]纯化了抗凝血功能的类凝血酶(14.4和17 kda的异二聚体); 吴忠和苏薇薇报道了具有止血活性的类凝血酶halase[11,12]。
自1993年起，本课题组尝试从尖吻蝮蛇蛇毒中分离具有止血功能的类凝血酶。目前，已获得5个以纤维蛋白原为底物的酶，进一步的研究发现，至少有2个酶具有止血活性，agacutin是被研究的最全面的一个。本文报道了agacutin的亚基拆分和n端15个氨基酸残基序列测定。
1 材料与方法
1.1 试剂
聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂、tris和caps{3[cyclohexylamino]1propanesulfonic acid} 购自promega公司;pvdf膜为biorad公司产品;可逆性蛋白质快速染色试剂盒为北京天为时代科技有限公司产品;agacutin类凝血酶由昆明龙津药业有限公司提供;其余试剂为国产分析纯。
1.2 仪器
miniprotean cell电泳槽、mini transblot电转移槽和powerpac hc电源均为biorad公司产品，水平电泳槽为北京六一仪器厂产品。
1.3 agacutin亚基拆分
1.3.1 sdspage分离 采用sds聚丙烯酰胺凝胶(胶浓度∶交联度=15∶3.9)，聚合过夜，用0.01 ma恒流预电泳2 h,上样后以200 v恒压电泳45 min。
1.3.2 可逆性蛋白快速染色 用蒸馏水冲洗电泳后凝胶，将胶置于玻璃培养皿中，加染色液50 ml,震荡5 min。待胶条带显现后，用蒸馏水冲洗2～3 min，洗去多余染液。将显色后的胶置于玻璃平板上，以黑色为背景，仔细切割分离亚基胶条。将回收的亚基胶条放入脱色液(0.25 mol/l trishcl,0.25 mol/l edta,ph 8.5)脱色20 min。条带消失后，用蒸馏水冲洗胶条并进行蛋白回收或电转移。
1.3.3 蛋白回收 将含2种亚基的胶条分别放入排阻分子量为10 kda的10 mm透析袋的一端，充满透析液，扎紧。将含胶条的一端置于水平电泳槽的阴极，在sdspage电泳缓冲液中120 v恒压2 h，再反向电泳1 min。剪去含胶条一端的透析袋，用缓冲液反复冲洗另一端的透析袋，回收缓冲液，用于鉴定单亚基的纯度或实行电转移。
1.3.4 单亚基纯度鉴定 采用sdspage电泳(t∶c=15∶3.9)，经考马斯亮蓝r250染色，并用脱色液脱至本底无色。
1.3.5 电转移
1.3.5.1 caps电转移缓冲液 取200 ml的caps储存液(caps 22.13 g，加去离子水至900 ml，用2 mol/l naoh调ph值至11.0，定容至1 l)，加甲醇200 ml和去离子水1 600 ml。
1.3.5.2 取pvdf膜，用甲醇浸泡10 s，然后放入caps电印迹缓冲液中。用caps缓冲液浸泡过物件按海绵-滤纸-pvdf膜-凝胶-滤纸-海绵的顺序装好夹层，放入小型电转槽中，在60 v恒压条件下，于室温下进行电转移，转移时间为1.5 h。
1.3.5.3 取出pvdf膜用去离子水略漂洗，用甲醇浸泡10 s，然后进行考马斯亮蓝染色(0.1%考马斯亮蓝r250溶于40%甲醇和1%乙酸)，染色50 s。用50%甲醇脱色后，用去离子水充分洗涤，剪下待测序的条带。
1.4 agacutin亚基的n端氨基酸残基测序
通过反相hplc分析和乙腈洗脱，采用edman降解法测定亚基的n端15个氨基酸残基序列(prociser clc 蛋白自动测序仪，applied biosystems co.),蛋白测序仪可自动显示测序峰。
2 结 果
2.1 agacutin纯品鉴定
agacutin纯品经sdspage电泳鉴定，在16和15 kda处显示相近的2条带(图1)。在该电泳条件下，2 μg的上样量显示亚基得到有效分离。
2.2 单亚基鉴定
agacutin纯品经sdspage电泳分离，可逆性蛋白快速染色，分别切下含2个亚基的条带，经电泳洗脱亚基单肽链。回收的亚基在sdspage电泳胶上分别显示16和15 kda的单一条带(图2)。
2.3 亚基电转移
电洗脱回收的2个亚基，经sdspage电泳浓缩为狭窄的条带，电印迹到pvdf膜，经考马斯亮蓝染色和脱色液脱色后，分别显示为单一蛋白条带(图2)。
2.4 亚基测序
2.4.1 对照样品测序结果 阳性对照见图3a，阴性对照见图3b。
2.4.2 小亚基测序结果 15 kda亚基n端15个氨基酸残基序列为dssgwssyegheyyv,见图4。
2.4.3 大亚基测序结果 16 kda亚基序列为dcssgwssyeehqyy，见图5。
3 讨 论
自20世纪70年代起，许多蛇毒蛋白酶如ancrod、batroxobin、crotalase和reptilase (立止血)等先后被发展成临床药物。这些药物在血液止血和栓塞疾病的治疗中扮演一定的角色。由于立止血在临床上的有效性和低毒性，该类凝血酶在1996年已成为国家基本药物。尖吻蝮蛇(agkistrodon acutus)主要分布在我国华南、台湾和泰国、缅甸，因此该蛇毒的研究主要集中在亚洲各国。根据sdspage技术和家兔血凝固时间变化，筛选了止血蛋白agacutin。在该蛋白酶的纯化过程中，尖吻蝮蛇蛇毒中许多分子量、等电点和凝结活性相近的蛇毒蛋白长时间地影响了纯化工艺。
figure 5 nterminal 15 amino acid residue sequencing of 16 kda subunit 本研究采用sdspage电泳方法，对组成类凝血酶agacutin的16和15 kda亚基进行了分离。通过切割分离含2个亚基的胶条，电洗脱回收，得到了单一亚基条带，并转移至pvdf膜进行了成功测序。从sdspage图谱可知，该蛋白质的15和16 kda两亚基非常相近，如果一种测序样品混合了很少量的另一种亚基肽链，测序结果可能不可靠。此外，拆分和测序结果成功与否，还取决于回收样品的鉴定结果和量。鉴于方法学的限制，本来就极少量的亚基纯品，在资金和仪器条件限制下，其鉴定过程就更加困难。本文通过sdspage、亚基胶条回收和电转移技术相结合，简单地解决了这样的测序问题，即使纯化样品纯度不高，该方法也很有效，所以该亚基分离方法和测序有一定的实际意义。
sdspage分析显示，agacutin是一个15和16 kda亚基组成的异二聚体。大亚基n端15个氨基酸残基序列为dcssgwssyeehqyy和小亚基序列为dssgwssyegheyyv。通过ncbi blast序列比较分析，15和16 kda亚基分别与凝血因子x结合蛋白agkisacutacin的a链有最大66.7%和73.4%的序列同源性(genbank accession no.1wt9 a [gi / 93278427], chain a, crystal structure of aaxbpi, a snake venom protein from deinagkistrodon acutus snake venom)。
按照新药申报模式，i类新药的蛋白质药物，必须测定n端15个氨基酸残基，以确定它是否是新的蛋白质。因为这样的n端序列完全同源有10-15可能性，所以该测序结果可直接为该化合物的申报奠定坚实的基础。另外，在该蛋白/基因的全序列未得出前，不能获得很多有益的信息。因为，对于接近300个氨基酸残基的蛋白质来说，n端15个序列显得太少。
蛋白亚基之间多由比较复杂的键相连接，主要有二硫键、离子键、疏水键等。在还原电泳条件下，agacutin亚基间的化学键被破坏，各亚基根据自身分子量大小排列而得到分离。本研究正是借助这种机理，将2个非常相近的亚基分离，并转移到pvdf膜上，通过切割含目的蛋白条带测序。
致谢:该研究工作获得昆明龙津药业公司资助,在此表示感谢!
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