【摘要】 目的：探讨重症肌无力（mg）患者眼外肌易于受累的机制。方法：采用rtpcr对正常人眼外肌、其他骨骼肌群（8例）以及mg患者肋间肌（10例）achrα、β、γ、ε、δ亚单位mrna的表达进行分析，同时采用elisa方法检测83例mg患者血清achr抗体对不同骨骼肌群achr的反应。结果：①正常人眼外肌与其他骨骼肌一样均可见achrα、β、γ、ε、δ亚单位mrna的表达；②全身型mg患者肌肉achrα p3a+/βactin较正常对照组高（p=0.028）；③眼肌型、全身型mg抗成人腓肠肌achr抗体显著高于抗胎儿肌肉achr抗体（p=0.001，0.016）。结论：mg患者眼外肌易受累机制可能与眼外肌achr亚单位mrna表达水平及眼外肌的内在易感性有关。
【关键词】 眼肌型重症肌无力 乙酰胆碱受体亚单位 乙酰胆碱受体抗体 眼外肌 mrna
achr subunit mrna expression in human muscles of patients with myasthenia gravis
jing yun, jia jianping, lu wei, ma shan.
neurology department, beijing tong ren hospital, capital medical university, beijing 100730, china
［abstract］ objective:to investigate extraocular muscles(eom) susceptibility to myasthenia gravis(mg).methods:acetylcholine receptor(achr) α, β, γ, ε and δ subunits from human eom and other different muscle groups from 8 health controls and intercostal muscles from 10 mg patients were studied by rtpcr system. serum achr antibodies from 83 patients with mg were assayed by elisa.results:①achrα, β, γ, ε and δ subunit mrna could be amplified from normal human eom and all muscle groups studied. ②achrα p3a+/βactin mrna was expressed at higher level in general mg than in health controls（p=0.028）. ③ocular and general mg patients had higher achr antibodies against achr from adult gastrocnemius muscle than that from fetus（p=0.001,0.016）.conclusion:susceptibility of eom to mg is likely associated with muscle achr subunit mrna expression and intrinsic susceptivity of eom.
［key words］ ocular myasthenia gravis；acetylcholine receptor subunit；acetylcholine receptor antibody；extraocular muscle；mrna
广义的眼外肌群（包括4条直肌、两条斜肌以及提上睑肌）是重症肌无力（myasthenia gravis, mg）最常受累的肌群。WwW.11665.cOm50%以上的mg患者以复视、上睑下垂等眼外肌无力为首发症状，其中50%～88%mg患者在两年内进展成全身型mg；90%mg患者在病程中出现眼外肌无力；大约10%～35%终生仅限于眼肌型mg［1］。本文对正常人眼外肌及眼肌型mg、全身型mg患者肋间肌乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor, achr)亚单位基因的表达以及mg患者血清achr抗体对不同肌群achr的反应进行研究，旨在探讨mg眼外肌易于受累的机制。
1 材料与方法
1.1 研究对象 于2002年1月～2003年1月在北京同仁医院、宣武医院神经内科就诊的mg患者83例（男38例，女45例），平均年龄35±24.5岁，按ossermann分型分为眼肌型59例、全身型24例；依mg实际发病年龄分为儿童型(≤14岁)29例、早发型（15～44岁）25例、迟发型（≥45岁）29例；对其中10例mg患者行胸腺切除术，该组手术患者平均年龄29.4岁，男女各5例，osserman ⅰ型5例，ⅱa型1例，ⅱb型4例，胸腺病理为胸腺增生7例，胸腺瘤3例。正常对照组40例（男14例，女26例），平均年龄33.3±12.1岁。神经系统疾病对照组12例（男、女各6例），平均年龄45.8±19.7岁。自身免疫性神经系统疾病对照组10例（男、女各5例），平均年龄41.5±20.5岁。经检验各组间没有显著性差异。
1.2 方法
1.2.1 肌肉标本 mg患者肋间肌标本于胸腔镜手术中取材；正常成人眼外肌标本10份、腓肠肌标本2份、竖脊肌、肋间肌标本各1份于非神经系统疾病手术中或意外死亡后2小时内获取；孕17周、24周胎儿下肢肌肉标本各一份来自引产胎儿（取材均经本人或家属知情同意）。所有肌肉标本在无rna酶防护下立即置于液氮中冷冻1～2小时，-80℃无rna酶保存。
1.2.2 血清标本 清晨空腹采集静脉血3 ml，分离血清于-80℃保存。
1.2.3 肌肉总rna提取、定量、鉴定以及rtpcr扩增achr亚单位基因 条件与方法见文献［2］。
1.2.4 骨骼肌achr提取、定量 参照lindstrom法提取成人眼外肌、腓肠肌及胎儿肌肉achr［3］。采用bca（bca protein assay reagent kit，pierce, usa）法对achr粗提液进行蛋白质定量，achr粗提液蛋白质含量约为2～4 mg/ml。
1.2.5 血清achr抗体检测 按elisa法用α银环蛇毒素(αbgt，sigma，usa）包被酶标板（corning, inc., usa），αbgt最适包被浓度为5 μg/ml，以0.5%bsa封板，经pbst依次洗板后逐步加肌肉achr粗提液（1 mg/ml）、1∶10稀释的待测血清或倍比稀释的混合阳性血清、酶结合物（最适浓度为1∶7 500）、底物opd，以2 mmol/l h2so4终止反应，于酶标仪（∑960，metertech, inc., usa）测492 nm吸光度。
1.3 统计学分析
1.3.1 采用凝胶图像扫描仪的软件分析系统（uvi band, braintain）对凝胶图像进行扫描。用spss 10.0软件对mg与正常对照组肌肉achrα p3a+/βactin、achrα p3a-/βactin比值进行方差分析、t检验。
1.3.2 以含achr抗体阳性的mg患者的混合血清作为标准血清，以标准血清的od值作纵坐标，以其浓度的对数值作横坐标，用spss 10.0分析软件求直线回归方程，待测血清achr抗体的含量根据od值由直线回归方程求得，以相当于阳性混合血清的百分数（%）表示。我们所作的多次直线回归方程的相关系数（r）是0.99±0.01，组间变异系数是1%；回归系数的决定系数（r2）是0.98±0.01，组间变异系数是1%，经f检验，p值是0(介于0～0.005 7)。用spss 10.0软件对achr抗体进行方差分析、t检验、配对t检验。
2 结果
2.1 17周、24周胎儿肌肉可见achrα、β、γ、δ四种亚单位mrna的扩增条带；正常成人眼外肌、竖脊肌、腓肠肌、肋间肌可见achrα、β、γ、ε、δ五种亚单位mrna的扩增条带；其中，achrα亚单位产生580、505 bp两个扩增条带，分别代表人肌肉achrαp3a+、achrαp3a-两种同源体［2］。βactin mrna的扩增条带可见于所有检测样本，见图1。
图1 人骨骼肌achrα、γ、ε亚单位rtpcr扩增产物电泳图（略）
fig.1 amplified achrα, γ, ε subunits and βactin of healthy human muscles after rtpcr
note:m.marker;16.17, 24 week fetus muscle, extraocular muscle, erector spinal muscle, intercostal muscle and gastrocnemius muscle. the expected sizes for achrα p3a+/p3a-, γ, ε subunits and βactin are 580/505, 280, 644 and 542 bp respectively.
2.2 全身型mg患者肌肉achrα p3a+/βactin(1.01±0.38)显著高于正常对照组（0.45±0.24），p=0.028，眼肌型mg患者肌肉achrα p3a+/βactin与正常对照组比较有差异，但无显著性意义。眼肌型、全身型mg患者achrαp3a-/βactin与正常对照组比较无显著性差异。
2.3 mg组针对三种肌肉achr的抗体水平较三个对照组显著性增高（p<0.05）；未发现眼肌型、全身型mg两组间针对三种肌肉achr的抗体水平的差异。眼肌型、全身型mg抗成人腓肠肌achr的抗体水平（89.2±107.2，87.9±100.8）显著高于抗胎儿肌肉achr抗体水平（67.0±81.3，67.8±87.3），p值分别是0.001，0.016，其中儿童眼肌型mg患者抗成人腓肠肌、眼外肌achr的抗体水平（104.5±124.4，80.3±90.6）显著高于抗胎儿肌肉achr的抗体水平（62.4±67.1），p值分别是0.007，0.013。
3 讨论
mg是一种主要由achr抗体介导的自身免疫性疾病。肌肉achr有两种亚型，胎儿型achr由α2βγδ亚单位构成，成人型achr由α2βεδ亚单位构成。关于mg眼外肌易于受累的机制一直以来争论不一。kaminski等［4］认为只有眼外肌同时有胎儿型achr与成人型achr亚单位表达，其他骨骼肌只表达成人型achr亚单位，胎儿型achr作为一种独特的靶分子提供了免疫系统攻击眼外肌的潜在可能性。难以解释的是，尽管上睑下垂是眼肌型mg常见症状之一，而且提上睑肌与其他眼外肌有着共同的胚胎起源与一样的结构特征，但提上睑肌并不表达胎儿型achrγ亚单位［5］。maclennan等［6］发现人眼外肌、肋间肌、腓肠肌胎儿型achrγ亚单位mrna表达相似，相反，成人型achrε亚单位mrna在眼外肌的表达远高于在其他肌肉的表达，而且，一些眼肌型mg患者的血清与成人型achr特异性结合。
本文结果显示，17周、24周胎儿下肢肌可见achrα、β、γ、δ四种亚单位mrna表达，符合胎儿型achr；成人眼外肌、竖脊肌、肋间肌、腓肠肌可见achrα、β、γ、ε、δ五种亚单位mrna表达，说明成人眼外肌与其他骨骼肌一样，同时表达胎儿型与成人型achr。有研究发现，在成熟肌纤维中，成人型achrε亚单位mrna表达主要局限于运动终板处突触膜下的胞核这一区域，而胎儿型achr即使在突触外区域有表达，achr抗体介导的对突触外区域胎儿型achr的免疫应答也不会引起神经肌肉接头传导阻滞［7，8］。
本组资料显示，眼肌型、全身型mg患者抗成人腓肠肌achr的抗体显著高于抗胎儿肌肉achr的抗体，儿童眼肌型mg抗两种成人肌肉achr的抗体显著高于抗胎儿肌肉achr的抗体，提示mg（尤其是儿童眼肌型mg）患者抗成人型achr抗原的反应更强。ohta运用等量混合的te671ε(成人型achr) 和 te671γ(胎儿型achr) 作为检测抗原，重新检测365例以胎儿型achr为抗原的achr抗体血清阴性型mg（seronegative mg，snmg）患者的血清，显示15.5%(17/110)眼肌型mg、12.9%(33/255)全身型mg患者achr抗体阳性，另有13.7%抗胎儿型achr抗体阴性的snmg患者抗成人型achrε亚单位抗体阳性［9］。因此，无论是眼肌型mg还是全身型mg，成人型achr都是获得性mg主要的靶抗原。
本组资料显示，全身型mg患者肋间肌achrα p3a+mrna表达高于正常人，眼肌型mg与正常人比较无显著性差异，提示病情严重的mg编码achrα亚单位mrna的水平较高。guyon等［10，11］发现，achrα、β、ε、δ亚单位mrna水平在病情较严重的mg患者中较高；asher等［12］曾在动物实验中发现，achr转录增加仅见于患病的动物，而没有患病的动物即使achr蛋白质表达减少20%也不见achr转录增加。wang等［13］研究发现，眼肌型mg抗achr的cd4+细胞对achr各亚单位的识别不如全身型mg稳定，这种低反应能力与大约只有40%～60%眼肌型mg可检测到achr抗体相一致，相比之下约80%～90%全身型mg achr抗体阳性。最近的研究表明，部分snmg的发病机理可能与肌肉特异性酪氨酸激酶（musclespecific tyrosine kinase, musk)抗体有关［14］。据mcconville报道，41%全身型snmg患者musk抗体检测阳性，但是眼肌型snmg患者无1例musk抗体阳性，同样提示眼肌型snmg的反应能力低下［15］。
mg眼外肌容易受累还可能与眼外肌本身的生理学特点有关：①任一条眼外肌轻微无力造成视轴的些微偏移均可能造成复视，因而易于被发现；②眼外肌有别于其他骨骼肌群，约20%眼外肌纤维受多神经支配，当突触后膜结构发生改变时，眼外肌更容易感受到肌无力；③眼球活动时快肌运动单位发放频率可高达600 hz，而其他运动单位最大频率不超过100 hz，在突触后膜achr数目减少的情况下，支配眼外肌的运动神经元高频率的重复刺激使眼外肌的突触较其他骨骼肌更容易发生肌无力；④眼外肌具有独特的解剖学特点，突触后膜的突触皱褶比较平坦，因而achr数目以及离子通道数目较少，平均囊泡含量也较肢体骨骼肌少，achr数、离子通道数、平均囊泡量少于肢体骨骼肌，会相应降低眼外肌收缩纤维神经肌肉接头的“安全系数”［4］。
mg患者眼外肌群易于受累的原因，一方面可能是眼肌型mg自身免疫应答比较弱，不足以影响眼外肌以外的肌群，另一方面可能是眼外肌本身更具易感性，因而常最先受累。
【参考文献】
1 tackenberg b, hemmer b, oertel w h et al. immunosuppressive treatment of ocular myasthenia gravis ［j］. biodrugs, 2001;15(6):369378.
2 景 筠，贾建平，马 山 et al. 重症肌无力患者胸腺achr亚单位基因的表达 ［j］. 中华神经科杂志，2005; 38(5):322323.
3 lindstrom j, einarson b, tzartos s. production and assy of antibodies to acetylcholine receptors ［j］. methods enzymol, 1981; 74:432460.
4 kaminski h. acetylcholine receptor epitopes in ocular myasthenia ［j］. ann ny acad sci, 1998; 841:309319.
5 kaminski h j, kusner l l, nash k v et al. the gammasubunit of the acetylcholine receptor is not expressed in the levator palpebrae superioris ［j］. neurology, 1995;45:516518.
6 maclennan c, beeson d, buijs a m et al. acetylcholine receptor expression in human extraocular muscles and their susceptibility to myasthenia gravis ［j］. ann neurol, 1997; 41(4):423431.
7 sanes j, johnson y, kotzbauer p et al. selective expression of an acetylcholine receptorlacz transgene in synaptic nuclei of adult muscle fibres ［j］. development, 1991; 113:11811191.
8 kaminski h j, ruff r l. ocular muscle involvement by myasthenia gravis ［j］. annals of neurology, 1997; 41(4):419420.
9 ohta k, fujinami a, saida t et al. frequency of antiachr epsilon subunitspecific antibodies in mg ［j］. autoimmunity, 2003; 36(3):151154.
10 guyon t, levasseur p, truffault f et al. regulation of acetylcholine receptor alpha subunit variants in human myasthenia gravis. quantification of steadystate levels of messenger rna in muscle biopsy using the polymerase chain reaction ［j］. j clin invest, 1994; 94(1):1624.
11 guyon t, wakkach a, poea s et al. regulation of acetylcholine receptor gene expression in human myasthenia gravis muscles. evidences for a compensatory mechanism triggered by receptor loss ［j］. j clin invest, 1998; 102(1):249263.
12 asher o, neumann d, witzemann v et al. acetylcholine receptor gene expression in experimental autoimmune myasthenia gravis ［j］. febs letters, 1990; 267:231235.
13 wang z y, diethelmokita b, okita d k et al. t cell recognition of muscle acetylcholine receptor in ocular myasthenia gravis ［j］. j neuroimmunol, 2000;108(12):2939.
14 vincent a, mcconville j, farrugia m e et al. seronegative myasthenia gravis ［j］. semin neurol, 2004;24(1):125133.
