【摘要】 目的：合成壬基酚与卵清蛋白的偶联物。方法：在磷酸盐（pbs，ph=8.0）缓冲液中利用甲醛通过曼尼希反应连接壬基酚与卵清蛋白（ova）；通过抗体芯片技术与紫外扫描鉴定偶联物。结果：壬基酚与ova偶联成功，壬基酚单克隆抗体对偶联物的识别浓度小于2.68 μg/ml。结论：本方法可用于壬基酚与卵清蛋白的偶联，且方法简单易实现。
【关键词】 壬基酚 卵清蛋白 甲醛
synthesis and identification of the conjugation of nonylphenol and ovalbumin
wang tao, gao zhixian.
institute of hygiene & environmental medicine, academy of military medical science, tianjin 300050, china
［abstract］ objective:to conjugate nonylphenol and ovalbumin（ova）.methods:nonylphenol was conjugated to ova by mannich reaction with formaldehyde in phosphate buffer（pbs, ph=8.0）.and we identified the conjugate by antichip and ultraviolet scan.results:nonylphenol was conjugated to ova successfully, and nonylphenol monoantibody recognized the conjugate less than 2.68 μg/ml.conclusion:this is an easy method to produce the conjugate of nonylphenol successfully.
［key words］ nonylphenol；ovalbumin；formaldehyde
近些年来的研究显示壬基酚是一种雌激素效应很强的环境内分泌干扰物质，相当于雌二醇的1/10 000～1/1 000［1，2］，而且可以在动物的脂肪组织内蓄积使其雌激素效应增强。wWw.11665.Com其雌激素效应主要体现在壬基酚可以导致动物体重和器官重量明显增加，雄性精子数量明显减少等生殖系统性能改变［37］。环境中的壬基酚主要来自壬基酚聚氧乙烯醚的微生物降解产物。壬基酚聚氧乙烯醚是一种良好的非离子表面活性剂，在洗涤剂等行业中被广泛使用。并且壬基酚本身也具有非离子表面活性而被广泛是用于化工、医药、造纸和洗涤剂等行业。因此，造成水体和淤泥不同程度的污染，壬基酚性质稳定，尤其在淤泥中（有氧条件下，3周降解80%），污染区域可自水边向外延伸100英里以上［8］。其检测方法目前主要依赖色谱法，虽然国外杂志曾报导过壬基酚人工抗原及抗体的制备，但多数人工抗原的制备是以羟基为特征官能团，而将烷基衍生与蛋白相连，产生抗体［9，10］。我们对壬基酚与蛋白的偶联方法进行了深入的探讨，最后在保留其两种特征官能团（19碳烷基和羟基）的前提下，成功地制备出壬基酚与卵清蛋白的偶联物。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试剂与材料 卵清蛋白（ova，华美生物工程公司）；壬基酚（np，aldrich公司）；40%甲醛（国产试剂）；乙酸乙酯（国产试剂）；醛基化玻片（cel associates，inc.）；cy3（amersham pharmacia biotech）；sephadex g50葡聚糖凝胶（sigma公司）；壬基酚单克隆抗体（日本友人赠送，1.75 mg/ml）。
1.1.2 主要仪器 蛋白核酸分析仪（beckmen公司）；pixsys芯片制备仪（点印）（catesian technologies，inc）；genepixtm4000b扫描仪（axon instruments，inc）；冷冻干燥仪（savant公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 壬基酚偶联物的制备
1.2.1.1 壬基酚与蛋白的偶联 曼尼希反应原理：在碱性条件下，酚羟基的临位活性很强，其上的氢很容易被取代。在pbs碱性缓冲液中利用甲醛形成甲撑将壬基酚羟基的临位与ova的氨基连接。
1.2.1.2 壬基酚与ova的偶联 将400 mg（约9 μmol/l）ova溶于50 ml pbs（ph 8.0）缓冲液中，在ova溶液中加入2 ml（约8 mmol）壬基酚，并立即边搅拌边滴加40%甲醛溶液，甲醛滴加过量，用1 mol/l naoh维持反应液的ph值在8.0左右，有白色絮状物质出现，继续搅拌2小时。将反应液过滤得到澄清的滤液，滤液封口放入4℃冰箱过夜。
透析袋煮沸1小时，将滤液倒入透析袋中，置于蒸馏水中透析6天，每天换1次蒸馏水。透析产物经冷冻、抽干得到白色絮状的偶联物。偶联物放入4℃冰箱保存。
1.2.2 人工抗原中ova与壬基酚偶联比例的确定 准确称取ova和偶联物1 mg分别溶于1 ml蒸馏水中备用；取20 μl壬基酚加至1 ml蒸馏水中制得壬基酚饱和溶液（壬基酚在水中的溶解度为6.35 mg/l）。以蒸馏水为空白对照，分别取100 μl上述3种溶液使用核酸蛋白分析仪进行紫外波长（220～450 nm）扫描检测。由于苯环的吸收峰在280 nm处，所以按下列公式粗略计算ova与半抗原的偶联比：
偶联比=a280（偶联物）-a280（ova）a280（壬基酚）×6.35×10-3×m（ova）m（壬基酚）。
1.2.3 偶联物的鉴定
1.2.3.1 偶联物的标记 准确称取1.5 mg壬基酚偶联物溶于1 ml pbs（ph 8.0）缓冲液，将该溶液加至cy3单标试剂管中，轻轻摇动，将荧光染料溶解并混合均匀，避光反应40分钟，每10分钟摇匀1次。反应后将混合液加到已经预平衡的sephadex g50葡聚糖凝胶柱中进行分离，取第1条带约4 ml。标记后的偶联物溶液置于4℃冰箱中备用。
1.2.3.2 壬基酚抗体芯片的制备 使用点样仪将壬基酚抗体按每区4×4点样于醛基片上，点样后的醛基片置于密闭的湿盒，将湿盒放入37℃水浴中固定2小时，取出芯片用冲洗液和蒸馏水洗去未固定的抗体蛋白。自然晾干后每区加20 μl封闭液在水浴中封闭2小时，取出芯片用冲洗液和蒸馏水洗去多余的封闭蛋白，晾干备用。
1.2.3.3 抗体芯片鉴定偶联物 用样品稀释液按1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶120和1∶140稀释偶联物标记液，分别制取30 μl备用。分别取偶联物标记液和稀释液20 μl，按自上至下、自左至右、自高浓度至低浓度加到制备的抗体芯片的1～9区，10区加20 μl样品稀释液作对照。再将芯片置于湿盒放入37℃水浴中反应2小时。最后将芯片取出用冲洗液和蒸馏水冲洗，晾干后使用芯片扫描仪扫描分析。
2 结果
2.1 白色絮状物质鉴定 取小部分白色絮状加至10 ml乙酸乙酯中，搅拌，白色物质未见溶解，因此白色絮状物质不是壬基酚彼此连接的产物（有机物易溶于有机溶剂），但不能确定是由甲醛引起的变性蛋白，因为在过滤后，在滤液中加入甲醛并未见白色絮状物质出现。鉴于这种物质是在加入naoh溶液后出现的，故另取50 μl壬基酚加至10 ml naoh溶液（1 mol/l），果然有白色絮状物质出现。因此，这种物质可能是壬基酚与naoh酸碱反应的有机盐产物。
图1 紫外扫描图（280 nm波峰处由上至下分别为偶联物、ova和壬基酚）（略）
fig.1 the uv spectra of the conjugate, ova and np
note:the three curves from up to down at 280 nm represented the spectra of the conjugate, ova and np in distilled water. the conjugate: 1 mg/ml, a280=2.630 1; ova: 1 mg/ml, a280=1.414 3; np: 6.35 mg/l, a280=0.042 3.
图2 芯片扫描图（两侧为标记后的偶联物溶液的稀释比）（略）
fig.2 the scanogram of antichip
note:monoclonal antibody(mab) to np was immobilized on the microchip. the conjugate was labeled with cy3, and diluted to different densities by dilution. the conjugate reacted with mab indifferent areas on the antichip, and the dilution was added to the last area as control. the lowest reactive density was 2.68 μg/ml.
2.2 偶联物中ova与壬基酚偶联比例的确定 采用核酸蛋白分析仪分别对偶联物、ova、壬基酚溶液进行紫外扫描，偶联物与ova在220～260 nm区间拟和很好，峰值均出现在280 nm附近（图1）。偶联物与ova在一级结构上无差别，其差别是在苯环含量上，表明偶联成功。将数据代入公式计算ova与半抗原的偶联比约为1∶30。
2.3 抗体芯片鉴定偶联物 芯片扫描图1～9区均有信号，信号值明显高于背景值。壬基酚抗体对偶联物识别浓度小于2.68 μg/ml（图2）。
3 讨论
franek等［9］曾将壬基酚的烷基衍生为—（ch2）9—cooh之后再与载体蛋白结合产生人工抗原。这种人工抗原暴露的或者说利用这种人工抗原产生的抗体的抗原决定簇只有一个酚基，抗体的特异性受到很大影响，也不利于利用免疫技术检测壬基酚。julia等［10］最近报道了一种与本实验原理相同的壬基酚人工抗原的制备方法，而且他们做的更加深入，并将这种人工抗原注射到兔体内，制备出相应的抗体血清，特异性较好，效价达到1∶600。
人工抗原的制备是否成功，关键取决于两个因素：一是合成的人工抗原是否保留了目的或特征官能团；二是合成的人工抗原能否成功的暴露目的或特征官能团。本实验直接将壬基酚利用甲醛通过曼尼希反应连接到卵清蛋白的氨基端，也就是在壬基酚的临位与蛋白的氨基间建立一个甲撑。理论上，小分子与载体蛋白间只用一个—ch2—这么小的连接距离，将对半抗原官能团的暴露造成很大的不良影响，但实验结果显示这并未对暴露造成影响。我们认为原因有两个：一是连接比例大，导致暴露几率高；二是过量甲醛与载体蛋白的氨基或其它位置结合，使蛋白的卷曲性减弱，更加有利于壬基酚两个官能团的暴露。实验中一个现象或许能够证明后一点，即在合成反应结束得到滤液后，取一些滤液并向其中再加入甲醛，却无沉淀出现。这与甲醛使蛋白变性沉淀的特性相悖。因此，我们推测这种现象是由于过量甲醛使部分蛋白变性，另一部蛋白的甲醛变性凝集位点被甲醛游离占据，形成蛋白—甲醛模式，而非蛋白—甲醛—蛋白的凝集模式，导致后加的甲醛无法使蛋白凝集沉淀。所以我们认为用这种方法来制备壬基酚偶联物是合理且易于实现的，至于该偶联物能否在动物体内产生抗体，还需要进一步实验确定。
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