高效液相色谱法同时测定鸭梨种子中3种内源激素
【摘要】 建立了高效液相色谱同时测定鸭梨种子中3种内源激素赤霉素(ga3)、生长素(iaa)和脱落酸(aba)含量的方法。采用c18反相色谱柱，柱温35 ℃，以甲醇水(含1%乙酸)(4∶6， v/v)为流动相，流速为1 ml/min， 检测器波长开始用254 nm， 2.5 min时将波长切换至210 nm，至3.8 min，ga3出峰结束后，再次将波长切换回254 nm测定iaa和aba。ga3、iaa和aba的平均回收率分别为92.8%、91.6%和94.7%。为快速、准确分离和测定鸭梨种子内源激素提供了一种可靠方法。
【关键词】 高效液相色谱; 内源激素; 鸭梨; 种子
simultaneous determination of three kinds of endogenous hormones content in seeds of postharvest yali pear by high performance liquid chromatography
yan shijie, guo liwei, wu caie, liang liya, wang jidong, zhang lina
1(food science department of tianjin agricultural university, tianjin 300384)
2(college of food science and engineering, shanxi agricultural university, taigu 030801)
3(college of forest resources and environment, nanjing forestry university, nanjing 210037)
abstract a high performance liquid chromatographic (hplc) method for the simultaneous determination of three kinds of endogenous hormone gibberellin (ga3), auxin (iaa) and abscisic acid (aba) content in seeds of postharvest yali pear was described. the chromatographic separation was carried out on a reverse phase c18 column using methanol∶water (containing 1% acetic acid)=4∶6 as the mobile phase at a column temperature of 35 ℃. the flow rate was 1 ml/min. uv detection at 210 nm was used for separation ga3 from 2.5 min to 3.8 min, while detection at 254 nm was used for the remaining separations. average recoveries were 92.8%, 91.6% and 94.7% for ga3, iaa and aba. it shows a reliable method for rapid, accurate separation and determination endogenous hormone in yali pear seeds.
keywords high performance liquid chromatography; endogenous hormones; yali pear; seed
1 引 言
果实的生长成熟是一个复杂的生理生化过程，植物激素与果实的发育及成熟程度有关，而种子又是激素合成的主要场所[1]，因此，掌握内源激素在种子中的变化规律，对研究水果在采摘后的生理、成熟、衰老及褐变过程具有重要意义[2]。WWW.11665.COm
植物激素在植物体内含量甚微，而且其在植物体内的组成复杂，相互共存的干扰组分多，对温度等条件敏感，因而对植物激素的测定比较困难[3]。高效液相色谱(hplc)是较理想的植物内源激素分析方法，植物激素的hplc测定已在仁用杏花芽[4]、甜樱桃[5]、梨[6]等果实， 油菜[7]、莴苣[8]等籽粒上有所应用，对植物种子方面，主要集中在银杏[9]、山楂[10]、甜樱桃[5]、五味子[11]、早蜜梨和黄金梨[6]等种子的激素含量测定上，而对鸭梨种子中激素的分离、测定还未见。由于在联合测定植物组织抽提液中的多种内源激素时，经常出现分离差、峰型不良及严重拖尾现象，因此选择合适的内源激素提取方法和色谱条件尤为重要[12]。本研究采用高效液相色谱法对鸭梨种子中的赤霉素(ga3)、吲哚乙酸(iaa)、脱落酸(aba) 3种植物激素进行联合分离与测定，建立起灵敏、简便、快速测定植物种子激素的方法。
2 实验部分
2.1 仪器、试剂与材料
1200 型高效液相色谱仪(美国agilent公司)，包括1200四元梯度泵、1200vwd检测器、hplc 2d工作站;kq 3200e型超声波清洗仪(昆山市超声仪器厂);re2000旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);ga3、iaa和aba标样(纯度≥99%，sigma公司);pvpp(sigma公司);甲醇(色谱纯，德国merck公司);乙酸、乙酸乙酯和石油醚(分析纯，天津大学科威公司);实验用水为超纯水。实验所选材料为北京市密云县不老屯镇燕落村的套袋鸭梨，于2008年9月16日采摘，于12 ℃预冷24 h后，放入(0±1)℃冷库中贮藏。贮藏期间每隔一定时间随机选取40个，挑出种子进行测定。
2.2 标准品的制备
分别准确称取0.01 g ga3、iaa和aba标样，用流动相溶解定容至100 ml棕色容量瓶中，作为母液(100 mg/l)，用以流动相、波长、柱温的选择和定性分析。以流动相为溶剂，分别配制100 mg/l ga3、10 mg/l iaa和2.5 mg/l aba的工作液。
2.3 样品的制备
样品前处理方法参照文献[13～15]，并加以改进。称取鸭梨种子1.0 g，液氮速冻并研磨成粉末，加入冷却的80%甲醇溶液10 ml(内含10 μg/l的抗氧化剂bht)，放置4 ℃冰箱中过夜，浸提液以13000 r/min离心15 min得上清液，残渣按1∶8和1∶4(w/v)分别加入80% 甲醇8和4 ml，重复浸提两次，合并3次所得的上清液，全部滤液于35 ℃减压浓缩至原体积1/3，再用1 mol/l na2hpo4调节至ph=8.0， 加入等体积石油醚萃取脱色3～5次，弃去酯相后，加入0.1 g聚乙烯聚吡咯烷酮(pvpp)吸附酚类物质，常温下摇床振荡30 min，过滤弃去pvpp，滤液用2 mo1/l柠檬酸调节至ph= 3，再用等体积乙酸乙酯萃取3～5次，合并酯相，于35℃减压浓缩至干，所得残留物加入3 ml ph 3.5磷酸盐缓冲液溶解，过seppak c18预处理小柱，进一步纯化ga3、iaa和aba，用80%甲醇洗脱收集后， 在40～43 ℃浓缩至干，用流动相溶解残渣并定容至2 ml，溶液经0.45 μm微孔滤膜过滤后进行hplc分析。
2.4 hplc条件
agilent c18zorbax 反相色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);柱温：35 ℃;流动相为v(甲醇)∶v(水，含1%乙酸)=4∶6; 流速： 1.0 ml/min;进样量：20 μl;采用切换波长法;以外标法进行定量测定。
3 结果与讨论
3.1 色谱条件的筛选
3.1.1 流动相的选择
流动相筛选实验发现，以v(甲醇)∶v(水)=5∶5为流动相，ga3， iaa和aba色谱峰拖尾严重，有平头峰，分离效果不理想(图1a)，加入适量乙酸可使三者分离效果得到改善，乙酸浓度对保留值和灵敏度影响不大，实验最后选择了含有1%乙酸的水溶液，既能保证3种激素完全分离，又能避免酸度太大造成色谱柱填料的损害。选用不同的比例的甲醇水作为流动相，对3种内源激素混合标样进行分离，实验发现，以v(甲醇)∶v(水)=7∶3为流动相，3种激素色谱峰均不能分开，rs≤0.3;以v(甲醇)∶v(水)=3∶7为流动相，灵敏度太低;以v(甲醇)∶v(水)=6∶4或5∶5为流动相，ga3和iaa的 色谱峰不能彻底分离;而以v(甲醇)∶v(水)=4∶6为流动相，3种激素的色谱峰的峰型尖锐，分离度高，重复性好(图1b)。本研究以甲醇水(含1%乙酸)(4∶6， v/v)为流动相。
3.1.2 波长的选择
将100 mg/l混合标准母液稀释10倍，分别在200～300 nm范围内进行光谱扫描，发现ga3，iaa和aba的最大吸收波长分别为210，250和265 nm。参考文献[4]的条件，在254 nm波长下同时测定3种激素，并对样品进行了测定(图2)，ga3响应值较低。采用hplc法分析多组分物质时常采用单一波长，但单波长检测不能使待测组分的响应值达到最大，切变波长可减少一些溶剂物质的干扰，更利于待测组分的分析检测[16,17]，所以本实验采用切换波长法检测植物内源激素。首先选择254 nm为检测波长，使溶剂峰较小化;在2.5 min 时ga3将要出峰，将检测器波长切换到ga3的最大吸收波长210 nm， 3.8 min出峰结束，再次将波长切换到254 nm处，对iaa和aba进行检测(图3)。虽然在254 nm下iaa和aba的吸收值未达到最大，但已接近于最大，并且可以避免多次切换波长造成的基线漂移。
3.1.3 柱温和流速的选择
柱温对分析时间影响较明显，柱温为20 ℃时，分离一个样品需25 min;柱温升为35 ℃时，分离一个样品只需15 min，因此选择柱温为35 ℃。随着流速的增加，各组分保留时间均缩短，但重叠现象也加剧;而流速太小则会延长测定时间，经过筛选确定最佳流速为1 ml/min。
3.2 内源激素的定性分析
用上述优化的色谱条件，对3种激素标准品进行分析(图4)。由图4可知，ga3，iaa和aba的保留时间分别为(2.928±0.072)min、(5.532±0.089)min和(11.956±0.054)min。
3.3 内源激素的定量分析
由图2可见，ga3在254 nm下响应值较低。采用切换波长法(图3)，可明显提高ga3的检测灵敏度，且3种组份均得到了良好分离。ga3， iaa和aba在样品色谱图中的保留时间分别为2.916， 5.525和11.962 min，与标准品色谱图中保留时间基本一致，说明本实验采用的样品分离和hplc色谱条件可以满足鸭梨种子中3种激素的同时测定的要求。
以3种激素的混合标准溶液为原液，分别稀释数倍，配制成含有ga3、iaa 和aba的系列标准溶液;在优化的色谱条件下依次进样，以峰面积为纵坐标(y)，质量浓度为横坐标(x)，计算得到各个内源激素的回归方程、线性范围和相关系数(表1)。由表1可见，3种激素标准品的浓度与峰面积相关性良好，相关系数均大于0.99。表1 激素在色谱条件下的标准曲线(略)
3.4 回收率的测定和实际样品分析
称取1.0 g鸭梨种子，按照2.3中方法制备样品并按照上述方法进行测定，在已测样品中加入精确称重的相当于样品0.5， 1.0， 2.0倍的标准样品，测定激素含量，计算加标回收率， 结果如表2所示。ga3， iaa和aba的平均回收率为92.8%， 91.6%和94.7%，相对标准偏差均小于6.7%，说明本方法符合定量分析要求，数据误差小，上述提取及色谱条件是可行的。
利用本方法对鸭梨种子内源激素含量进行了测定，并对贮藏中含量变化进行了跟踪。结果表明：鸭梨贮藏过程中，种子内的ga3和iaa含量呈先降后升，再降再升的变化趋势，ga3含量最高为349 μg/g， 最低为163 μg/g;iaa含量最高为 9.13 μg/g，最低为 2.45 μg/g。aba含量呈逐渐下降的趋势，初始值为 1.58 μg/g，贮藏末期降至 0.36 μg/g。本方法能够满足对鸭梨贮藏中种子激素变化的检测要求，为进一步研究鸭梨种子激素代谢与果实褐变的关系奠定了基础。表2 激素的加标回收率(略)
【参考文献】
1 nitsch j p. hormonal factors in growth and development. hulme a c. the biochemistry of fruits and their products. london, new york:academic press, 1970： 427～472
2 yan shijie(闫师杰). study on influence factors and mechanism of browning of yali pear fruit after harvest(鸭梨采后果实褐变的影响因素及发生机理的研究). beijing(北京): china agricultural university(中国农业大学), 2005: 98
3 chen bolang(陈波浪)， zheng chunxia(郑春霞)， sheng jiandong(盛建东). journal of xinjiang agricultural university(新疆农业大学学报), 2006， 29(1)： 28～30
4 yang tuxi(杨途熙), wei anzhi(魏安智), zheng yuan(郑 元), yang heng(杨 恒), yang xiangna(杨向娜), zhang rui(张 睿). chinese j. anal. chem.(分析化学), 2007, 35(9)： 1359～1361
5 liu binghua(刘丙花), jiang yuanmao(姜远茂), peng futian(彭福田), zhao fengxia(赵凤霞), wang haiyun(王海云), zhao lin(赵 林). journal of fruit science(果树学报), 2008, 25(4): 593～596
6 liao mingan(廖明安), liu xu(刘 旭), deng guotao(邓国涛), chen shanbo(陈善波),ren yajun(任雅君), liu weiguo(刘卫国). journal of fruit science(果树学报), 2009， 26(1)： 25～31
7 zhang w, sheila d s, russell t, lawrence v g. j. plant growth regul(on line), 2009, (9)
8 sheila d s c, suzanne r a, stephen j a, adrian j c, mart l, andrew r s r， allison r k. the plant joural, 2003， 35(3): 405～417
9 wang jian(王 建), wang jiuling(王九龄), wei gang(魏 刚), xin xuebing(辛学兵). forest research(林业科学研究), 2001, 14(1): 106～109
10 zhang peiyu(张培玉), yang xiaoling(杨晓玲), xiang dianfang(项殿芳), qi yongshun(齐永顺), guo mingjun(郭明军), yang yuedong(杨越冬). journal of hebei agrotechnical teachers college(河北农业技术师范学院学报), 1999, 13(1): 7～10
11 qi yongping(齐永平), gu wei(顾 蔚), luo cheng(罗 成), wang zhezhi(王喆之). plant physiology communications(植物生理学通讯), 2009, 45(6): 615～618
12 zeng qingqian(曾庆钱)， chen houbin(陈厚彬)， lu caihao(鲁才浩). journal of fruit science(果树学报), 2006, 23(1)： 145～148
13 ding jing(丁 静)，shen zhende(沈振德)，fang yixiong(方亦雄). plant physiology communications(植物生理学通讯), 1979， 15(2)： 27～39
14 chen kunsong(陈昆松), xu changjie(徐昌杰), li fang(李 方), chen qingjun(陈青俊), zhang shanglong(张上隆). journal of fruit science(果树学报)， 2003, 20(1)： 4～7
15 wu gengxi(吴耕西), bi guihong(毕桂红). journal of shangdong agricultural university(山东农业大学学报), 1994， 25(1)： 51～55
16 gao guizhi(高桂枝), xu aijun(徐爱军), yu mei(虞 梅), yuan shanshan(苑姗姗). journal of modern agricultural science and technology(现代农业科技), 2007， (3)： 9～1117 liu zhiyong(刘志勇), wang jun(汪 军), yue xiali(岳霞丽), dong yuanyan(董元彦). chinese journal of spectroscopy laboratory(光谱实验室), 2006， 23(2)： 285～288
