河北省未治疗患者体内hiv毒株耐药基因检测研究
【关键词】 hiv; 未抗病毒治疗; 基因型耐药性
【摘要】 目的 研究河北省未接受抗hiv治疗患者体内hiv毒株耐药突变情况，为开展临床抗病毒药物治疗和制定合理的用药方案提供数据支持。方法 rtpcr技术扩增hiv pol区基因，双脱氧法测定hiv基因序列，并使用contig express软件处理原始核苷酸序列，与stanford hiv drug resistance database (hivdb.stan ford.edu) 进行对比分析耐药突变情况。结果 10例患者hiv毒株基因亚型分析结果均为b亚型。发现存在大量逆转录酶和蛋白酶抑制剂继发耐药变异。结论 河北省未治疗患者体内hiv继发耐药变异的存在提示要及早进行耐药检测，适时调整治疗方案。
【关键词】 hiv; 未抗病毒治疗; 基因型耐药性
study of genotypic antiretroviral resistance testing of hiv strains in untreated hiv/aids patients in hebei province zhao hongru,lu xinli,zhao cuiying,et al. hebei center for disease prevention and control,shijiazhuang 050021,china
【abstract】 objective to study the drug resistance mutations of hiv1 strains in untreated hiv/aids patients in hebei province, and to provide the baseline data for clinical antiviral treatment and suitable therapeutic schedule.methods the partial pol sequences were amplified by rtpcr ,then the gene segment was sequenced. the results of hiv genic sequence were treated by contig express and were compared with the stanford hiv drug resistance database to analyze the state of hiv drug resisitance. results (1)phylogenetic analysis indicated that hiv genic subtypes of 10 patients were classified as subtype b.(2) lots of secondary mutations were related with rt inhibitor and pi inhibitor . conclusion the results reveals that untreated patients with hiv have acquired many secondary mutations in their pr and rt genes , which suggests us to pay much attention to the detection of drug resistance mutations and the adjustment of suitable therapeutic schedule in time.
【key words】 human immunodeficiency virus; non-antiviral teatment; genotypic antiretroviral resistance
抗逆转录病毒药物的广泛应用，特别是高效抗逆转录病毒治疗(haart)能有效抑制hiv感染者体内病毒复制，改善临床症状，延长寿命。wwW.11665.CoM但hiv耐药突变所导致的交叉耐药和多重耐药严重降低了hiv治疗效果[1，2]。随着中国艾滋病患者的迅速增加，将会有越来越多的患者接受haart治疗，耐药变异研究日显重要。由于hiv1基因的高度变异性以及耐药性毒株的传播，未经抗病毒治疗的患者也可能携带耐药性hiv毒株。为此本研究选取河北省10例未经抗病毒治疗的hiv/aids患者进行了蛋白酶和逆转录酶的基因型耐药突变分析。
1 对象与方法
1.1 研究对象 10例hiv/aids患者来源于河北省，均未接受抗病毒治疗。经省艾滋病确证中心实验室western blot(wb)试验确证为hiv阳性，病毒载量≥1 000 copy/ml。10例患者按中国1996年发布的《hiv/aids诊断标准及处理原则》(gb160001995)病例分类及扩大的诊断标准分为艾滋病期(cd4+t淋巴细胞<200/μl) 和无症状期(cd+4t 淋巴细胞≥200/μl)。
1.2 标本采集与处理 用edta3k抗凝采血管采集hiv/aids 患者外周静脉血,采血时间为2008年4月，取抗凝血50 μl测定cd+4t淋巴细胞数,剩余全血经离心分离血浆后-80℃冻存。
1.3 cd+4t 淋巴细胞测定 用美国bd公司的流式细胞仪(facscount) 测定cd+4t 淋巴细胞绝对值。
1.4 hiv载量测定 采用rtpcr方法，使用美国roche公司的cobas ampllcor自动载量仪及配套试剂盒测定病毒载量。测定的病毒载量数值以病毒载量的lg计算。
1.5 hiv1 rna 提取 采用德国qiagen公司qiaamp viral rna mini kit 提取hiv1 rna，严格按照说明书进行操作。
1.6 hiv蛋白酶基因序列和逆转录酶基因序列的扩增 引物设计:参照hiv野生株(hxb2, 基因库编号k03455)的序列,设计pcr扩增引物。见表1。(2)目的基因片段的扩增:rtpcr反应(逆转录及第一轮pcr):采用takara one step rna pcr kit(amv)，严格按照说明书的要求进行操作，使用1.5 ml离心管配制rtpcr反应体系。见表2。按每管20 μl将配制好的反应体系分装至pcr管中，注意将液体加至管底。将混合物混匀并短暂离心后放入pcr仪中，设定并运行程序(50℃ 30 min;94℃ 2 min;94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1.5 min，30循环;72℃ 7 min，4℃保温)。第二轮pcr：使用takara perfectshot tm ex taq mix试剂盒，按照rtpcr的方法配制50 μl反应体系。见表3。将配制好的混合物短暂离心后分装到盛有4 μl第一轮pcr产物的pcr管中，混匀后放入geneamp 9 700 dna扩增仪中，设定并运行程序(94℃ 5 min;94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 2.5 min，30 循环;72℃ 10 min,4℃，保温)。见表3。表1 扩增用引物序列和位置表2 rtpcr反应体系
1.7 扩增产物的鉴定 利用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr产物，并以dna marker (dl2000)作为电泳参照物。见图1。
图1 pcr扩增结果电泳图谱 m:dna marker (dl2000); n:阴性对照;84～93为标本
1.8 核苷酸序列测定及分析 序列测定由中国军事医学科学院艾滋病检测中心李韩平博士完成。使用contig express软件做序列拼接处理原始核苷酸序列，参照测序图谱进行基因序列修订后, 直接进入stanford hiv drug resistance database (hivdb. stanford.edu)进行分析。
1.9 统计学分析 应用spss 13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 hiv载量和cd4细胞数的相关性分析 将10例患者共进行53次随访，同时测定其cd4淋巴细胞数和病毒载量值，在42份(79.2%)cd4淋巴细胞计数<400个/mm3标本中，有36份(85.7%)hiv rna病毒载量>103 copy/ml。在8份(15.1%) cd4细胞计数<200个/mm3的样本中，均可检测到超过104 copy/ml的hiv rna病毒载量。然而只有3份(5.7%)血浆样本中cd4计数>400个/mm3，其中hiv rna病毒载量>104 copy/ml的样本只有1份，其余2份hiv rna病毒载量均小于103 copy/ml。结果表明在10例hiv/aids患者的ig(rna)和cd4淋巴细胞数之间显负相关疑(t=-0.487,p<0.05)，并且随着cd4细胞数下降越多, 病毒载量升高越明显。
2.2 10例hiv/aids患者临床特征 10例感染者中男7例，女3例;年龄30～66岁，平均年龄44岁;平均感染时间5年;血液传播8例，门诊患者1例，性途径1例。对pol 区测序结果进行hiv 亚型分析:结果显示10例感染者均为b亚型。见表4。表4 10 例hiv/aids 患者临床特征注：as：无症状
2.3 逆转录酶(rt)耐药变异 10例感染者均不存在rt原发耐药变异，但均存在不同程度的rt继发耐药变异。逆转录酶第103位点变异(k103n) 能导致对所有nnrti 高度耐药[3],本研究检测到存在k103e/k变异，该变异及其少见，为rt的自然多态性，不会降低任何药效。见表5。表5 10例hiv/aids 患者逆转录酶耐药变异与亚型和疾病进展的情况例
2.4 蛋白酶耐药变异 10例患者中未发现蛋白酶原发耐药变异，但存在大量蛋白酶耐药继发变异k14r[n=1(10%)]、i15v[n=2(20%)]、q18h[n=1(10%)]、l19v[n=1(10%)]、e35d[n=8(80%)]、r41k[n=3(30%)]、l63p[n=8(80%)]、h69r[n=1(10%)]、a71v[n=1(10%)]、i72v[n=5(50%)]、v77i[n=7(70%)]、l89m[n=1(10%)],i93l[n=9(90%)]。未发现明显的亚型特异性耐药变异，蛋白酶耐药继发变异与疾病进展无相关性(p<0.05)。见表6。表6 10例hiv/aids患者逆转录酶耐药变异与亚型和疾病进展的情况例
3 讨论
一般在用药早期出现原发耐药变异，其直接影响抗病毒药物作用靶位点，明显降低一类或一种抗病毒药物药效，甚至使其失效，具有药物特异性。继发变异纠正由原发变异导致的复制缺陷，并存储病毒变种的复制能力，提高病毒的耐药性，保护和促进原发变异的发生[4，5]，适时调整合理的用药方案可使耐药突变率降低30%～50%[6]。因此加强对河北省hiv耐药毒株的检测或监测，以便及时调整用药方案，减少耐药毒株的产生。本研究对河北省未接受过抗病毒治疗的10例hiv/aids患者进行了hiv蛋白酶和逆转录酶耐药变异基因型分析。有研究表明河北省流行的hiv1毒株主要为b亚型，尤其是与血液途径感染hiv有关的人员均为b亚型[7，8]，本次研究的10例hiv/aids患者均为b亚型，与此前的研究结果相一致。
所有患者都存在蛋白酶继发耐药变异(k14r、i15v、q18h、l19v、e35d、r41k、l63p、h69r、a71v、i72v、v77i、l89m,i93l)，其出现频率显著高于国外报道[9]。研究证明蛋白酶原发变异与继发变异共存时，能导致蛋白酶抑制剂的交叉耐药和多重耐药[10，11]。在10例患者中没有发现nrti和nnrti相关原发耐药变异，但在艾滋病患者中出现逆转录酶继发耐药变异(v35t、e44ek、k122e、i135iv、i142v、s162c、t200a、q207k、r211kr、k277r、q278e、i293v)，这些变异可能是随着疾病进程产生的自然变异结果。继发耐药变异的广泛存在提示：应及时进行耐药变异检测，及早发现耐药变异，防止多重耐药和交叉耐药出现及流行。
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