河北地区人群骨桥蛋白基因多态性与冠心病的相关性
【关键词】 骨桥蛋白;多态性;冠状动脉粥样硬化性心脏病;冠状动脉造影
【摘要】 目的探讨河北地区人群骨桥蛋白基因启动子-443t/c、-156delg/g和-66t/g三个多态性位点与冠心病发生之间的相关性。方法随机选择中国河北地区95例经冠状动脉造影检查并确诊为冠心病的患者及129例正常对照。提取外周血基因组dna，采取特异性引物对所选区域进行pcr扩增，将扩增产物进行测序后统计基因型和等位基因在病例组和对照组中的分布情况。结果-443t/c、-156delg/g两个snp位点在冠心病患者组与正常人对照组中分布无明显相关性(p>0.05)，而-66t/g位点在该地区不具备明显多态性。结论骨桥蛋白基因启动子区-443t/c、-156delg/g两个snp位点与冠心病发病无关。
【关键词】 骨桥蛋白;多态性;冠状动脉粥样硬化性心脏病;冠状动脉造影
【abstract】objectiveto investigate the relationship between coronary heart disease (chd) and three single nucleotide polymorphism sites (-443t/c, -156delg/g, -66t/g) in the gene of osteopontin promoter region.methods95 chd patients and 129 healthy volunteers were randomly selected from hospitals in hebei province.dna was extracted from peripheral blood samples.the target segment was amplifiedwith specific primers.dna sequencing was performed to detect the alleles.the distribution of genotypes and alleles in the two groups was analyzed.resultsthe distribution of genotypes and alleles for -443t/c and -156delg/g was not related to chd (p>0.05). no detectable polymorphism for -66t/c was detected inthis province.conclusionsthe -443t/c, -56delg/g in the gene of osteopontin promoter might not be related to the chd in hebei province.
【key words】osteopontin; polymorphism; coronary artery disease; coronary angiography
以往研究发现，骨桥蛋白(opn)可以促进血管平滑肌细胞的黏附和迁移，在动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄中具有重要作用〔1〕。wWw.11665.cOmopn基因启动子区有多个单核苷酸多态性(snp)位点，该基因启动子区的多态性对其基因的转录起着重要的调节作用〔2〕。然而，opn基因的snp位点与冠心病之间的关系尚不十分明确。因此本研究针对opn基因启动子区的三个可以调节opn基因表达的已知snp位点(-443t/c、-156delg/g和-66t/g)进行病例-对照分析，观察这三个snp位点与冠心病之间的关系，为探讨opn基因多态性在冠心病的预防、治疗中提供一定的遗传学基础。
1对象与方法
1.1对象冠心病患者随机取自河北医科大学第二医院于2007年4月至2008年12月在心内科的住院病人95例，其中男74人，女21人，年龄32~79〔平均(58.7±9.8)〕岁，所有病人均经冠状动脉造影检查并确诊为冠心病患者。对照组随机取自河北省直体检中心并经各科检查无异常的健康人129例，男64例，女65例，年龄22~78〔平均(42.8±14.2)〕岁。所有观察对象 之间均无血缘关系。
1.2方法
1.2.1标本采集
所有研究对象(患者于冠脉造影前)均取晨间空腹外周静脉血，存于含有0.2 ml的2%乙二胺四乙酸二钾(edta-k2)采血管中，-70℃保存。
1.2.2基因组dna提取
使用血液基因组dna快速分离试剂盒(北京博大泰克生物公司)按使用说明提取血液标本中的基因组dna。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。并将提取的基因组dna保存于-70℃。
1.2.3pcr扩增及产物鉴定引物设计与合成按文献〔3〕所提供引物序列(上游：5′tgtcactagtgccatttgt3′，下游：5′tgtaccttggtcggcgtttg3′)由上海生工生物工程公司合成引物。反应体系：基因组dna模板(50 ng/μl) 9 μl，10×pcr反应缓冲液 6 μl，mgcl2 (25mmol/l)6 μl，taq dna聚合酶(5 u/μl)1.5 μl，dntp (10 mmol/l)1.5 μl，上下游引物(10 μmol/l)各3 μl，去离子高压灭菌水30 μl，总反应体系60 μl。反应条件：首先94℃预变性5 min，随后94℃变性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸45 s共30个循环，之后72℃保持10 min。取pcr产物3 μl于1%琼脂糖凝胶中在120 v电压下电泳17 min，紫外分析仪下鉴定。将上述pcr产物送至上海生工生物工程公司北京测序部测序，使用abi prism 3730xl测序仪双向测序。
1.3统计学分析
用hardy-weinberg平衡检验样本群体的代表性。使用在线shesis(http://analysis.bio-x.cn/myanalysis.php)软件〔3〕计算两位点之间的连锁不平衡。运用spss13.0软件进行组间基因型和等位基因的频率χ2检验。
2结果
2.1测序结果
经测序，三个多态性位点中-156和-443处各有三种基因型，而-66位点处仅有一种基因型，见图1。图1-443t/c、-156delg/g和-66t/g三位点测序图谱(图中箭头所示为突变位点)
2.2统计学结果
所取的病人组及对照组均符合hardy-weinberg平衡(p>0.05)。-443t/c和-156delg/g两位点存在连锁不平衡(d′为0.941，r2为0.344)。-66t/g在冠心病组和对照组中均为t/t基因型，-443t/c和-156delg/g两位点基因型及等位基因的分布在两组中均无明显相关(p>0.05)，见表1及表2。表1冠心病组与对照组-156delg/g基因型分布及等位基因频率比较表2冠心病组与对照组-443t/c基因型分布及等位基因频率比较
3讨论
opn是一种分泌型糖基化磷蛋白，其基因定位于人类4号染色体。有研究表明该蛋白在抗炎和损伤修复过程中有重要作用，其基因多态性与女性1型糖尿病〔4〕、系统性红斑狼疮〔5〕以及多发性硬化〔6〕等疾病有关。冠心病的发病有多种危险因素，如年龄、性别、2型糖尿病、血脂与血压等都可以影响冠心病发病。因此，冠心病的发病过程涉及多个基因的共同作用。这些基因的产物可能作用于opn基因，使opn的表达或功能发生变化。以往研究发现，其中血opn含量影响冠心病的形成和发展程度〔7〕。然而，国内外研究opn基因多态性与冠心病关系的报道较少，因此，本文选择opn基因启动子区三个可以调节opn基因转录的snp位点-443t/c、-156delg/g和-66t/g，采用pcr联合序列测定的方法进行分析。研究结果显示，-443t/c、-156delg/g两个多态性位点与河北地区冠心病发病无明显相关性(p>0.05)，说明这两个位点不是河北地区人群冠心病发病的主要因素。另外，测序结果发现-66t/g位点只有t/t纯合基因型，与国外研究结果不一致〔2〕，其原因主要与种族、地区差异和观察对象数量等原因有关，说明该位点在河北地区人群中可能不具备显著的多态性。本研究发现，opn基因启动子区-443t/c、-156delg/g和-66t/g三个snp位点尚不能作为冠心病的危险因素来指导临床诊断和治疗，对于opn基因snp位点与冠心病易感性之间的关系尚需进一步研究。
【参考文献】
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