id-1在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达及意义
【关键词】 宫颈癌;宫颈上皮内瘤变;id-1;dna结合抑制因子-1;实时荧光定量rt-pcr
【摘要】 目的 通过检测宫颈癌及其癌前病变组织中dna结合抑制因子-1(id-1)蛋白和mrna的表达情况，探讨id-1在宫颈癌变过程中的作用。方法 采用免疫组化sp法检测id-1蛋白在15例慢性宫颈炎、17例cinⅰ、25例cinⅱ～ⅲ和79例宫颈癌组织中的表达;采用实时荧光定量rt-pcr法检测id-1 mrna在10例慢性宫颈炎、8例cinⅰ、9例cinⅱ～ⅲ和8例宫颈癌组织中的表达。结果 慢性宫颈炎、cinⅰ、cinⅱ～ⅲ、宫颈癌组织中id-1蛋白表达阳性率呈逐渐升高趋势(p<0.01)，分别为0、11.8%、40.0%、74.7%;cinⅰ、cinⅱ～ⅲ和宫颈癌组织中id-1 mrna的相对表达量分别是慢性宫颈炎组织的1.34倍、3.42倍和10.37倍，随宫颈癌变程度加重id-1基因表达增加(p<0.05)。结论 随着宫颈癌变程度加重，id-1表达逐渐增加，表明id-1可能参与了宫颈癌的发病机制。
【关键词】 宫颈癌;宫颈上皮内瘤变;id-1;dna结合抑制因子-1;实时荧光定量rt-pcr
[abstract] objective to investigate the effect of the inhibitor of dna binding-1(id-1)in the process of carcinogenesis of cervical cancer by detecting the expression of id-1 protein and mrna in the cervical cancer and its precancerous lesions.methods the expressions of id-1 protein in 15 chronic cervicitis, 17 cinⅰ, 25 cinⅱ-ⅲ and 79 cervical squamous cancers were assessed by immunohistochemical sp methods. real-time fluorescence quantitative rt-pcr (qrt-pcr) was used to detect the expression level of id-1 mrna in 10 chronic cervicitis, 8 cinⅰ, 9 cinⅱ-ⅲ and 8 cervical squamous cancers respectively.results it was found that the expression level of id-1 protein followed this pattern: cervical cancer > cinⅱ-ⅲ > cinⅰ> chronic cervicitis (p<0.01), and the positive expression rate of id-1 protein was 74.7%, 40.0%, 11.8%and 0.0% respectively. the relative amount of id-1 mrna expression in cinⅰ, cinⅱ-ⅲ and cervical cancer is respectively 1.34 times, 3.42 times and 10.37 times of that in the chronic cervicitis, which indicates that the id-1 mrna expression increases with the proceeding of cervical affection.conclusion the id-1 expression was increased with the aggravation of cervical lesions. it suggests that id-1 might have participated in the pathogenesis of cervical squamous cell carcinoma.
[key words] cervical cancer; cin; id-1; inhibitor of dna binding-1; real-time fluorescence quantitative rt-pcr
近年研究发现，dna结合抑制因子-1(id-1)作为一种转录调节因子在多种上皮来源的恶性肿瘤中表达升高，并且与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡及血管生成等有关[1]。WWw.11665.Com目前对id因子与宫颈癌的相关研究国内外仅见一篇报道，即schindl等[2]的研究，但对id-1在宫颈癌变过程(慢性宫颈炎cinⅰcinⅱ～ⅲ→宫颈癌)中的研究尚未见报道。为此笔者采用免疫组化sp法和实时荧光定量rt-pcr法，首次定性与定量研究id-1蛋白和mrna在慢性宫颈炎、cinⅰ、cinⅱ～ⅲ和宫颈癌组织中的表达，初步探讨id-1在宫颈癌发生发展中的作用及意义，为宫颈癌的病因学研究和基因靶向治疗提供一个新线索。
1 材料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 免疫组化
选取我院病理科保存的2004-2009年宫颈癌变相关组织石蜡标本136例，患者年龄23～68岁，平均(42.56±8.20)岁。依据病理表现分四组，即慢性宫颈炎组15例、cinⅰ组17例、cinⅱ～ⅲ组25例、宫颈癌组79例。所有标本均由≥2名的病理学专家再次阅片确诊。选定的石蜡标本均经中性甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片。
1.1.2 实时荧光定量rt-pcr
经伦理委员会批准并取得患者知情同意后，选取2008年10月-2009年10月在我院行宫颈活检或子宫切除术的患者作为本研究对象。所有患者术前均未接受放、化疗或手术治疗。所取新鲜组织标本大小约0.5cm×0.5cm×0.5cm，液氮保存备用。最后根据病理结果纳入慢性宫颈炎组10例、cinⅰ组8例、cinⅱ～ⅲ组9例、宫颈癌组8例，共35例，年龄26～57岁，中位年龄37岁。阳性对照为卵巢癌1例，年龄55岁。
1.2 实验方法
1.2.1 免疫组化sp法检测id-1蛋白的表达
(1)一抗id-1兔抗人多克隆抗体购自美国santa cruz公司，免疫组化sp超敏试剂盒为天津津脉基因测绘技术有限公司产品。具体实验步骤按照说明书进行。以磷酸盐缓冲液(pbs)代替一抗作阴性对照，阳性对照由santa cruz公司提供。(2)采用olympus光学显微镜观察各试验组宫颈组织中id-1表达情况，由2名试验人员双盲法独立分别对试验结果进行半定量评分，最终结果取均值或协商确定。id-1免疫组化阳性着色主要定位于胞浆，为棕黄色或棕褐色。根据着色深浅和阳性细胞比例对免疫组化结果进行半定量评分，确定表达强度分级。具体评分标准见参考文献[2]。
1.2.2 实时荧光定量rt-pcr检测id-1 mrna的表达
(1)trizol提取组织总rna，-70℃保存备用。(2)id-1和β-actin基因引物和taqman探针由takara公司合成，见表1。(3)id-1基因为单外显子，逆转录前用dna酶处理。按照revert aid tm first strand cdna synthesis kit试剂盒(立陶宛mbi 公司)说明书进行操作，逆转录获得cdna。逆转录条件为20℃ 10min → 42℃ 60min → 70℃ 10min，-20℃保存备用。(4)标准曲线的制备：用假定初始拷贝数(x)的cdna模板按10倍梯度进行稀释，自每个稀释模板中取样2μl，分别加入30μl的反应体系中行实时荧光定量rt-pcr。扩增条件为94℃预变性2min;94℃ 20s，54℃(id-1)/52℃(β-actin)20s，60℃ 30s，45个循环;最后60℃延伸5min。将pcr仪的荧光采集时间统一设定在扩增反应的延伸期，在该时相读取ct值。(5)待测样本目的基因相对拷贝数的测定：将逆转录得到的cdna样品各取2μl，加入和上面完全相同的反应体系，在同样的反应条件下行pcr扩增，测定各样品的ct值，采用比较阈值法计算目的基因拷贝数=2-δδct，δδct=(ctid-1-ctβ-actin)试验组-(ctid-1-ctβ-actin)参照组。本研究目的基因为id-1，管家基因为β-actin，参照组为慢性宫颈炎组。2-δδct表示的是试验组目的基因的表达相对于参照组的变化倍数。表1 id-1和β-actin基因引物及探针序列
1.3 统计学分析 应用spss13.0软件系统对所得数据进行统计学处理，检验水准取双侧α=0.05。统计方法包括χ2检验、单向方差分析(one-way anova)。
2 结果
2.1 id-1蛋白在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达 慢性宫颈炎组织中未见id-1蛋白阳性表达，而宫颈癌及癌前病变组织中均有不同程度的id-1免疫阳性反应，主要定位于细胞质，表现为棕黄色或黄色颗粒样物质。id-1表达阳性率随宫颈癌病变程度的加重而升高，在慢性宫颈炎、cinⅰ、cinⅱ～ⅲ和宫颈癌组织中id-1阳性表达率分别为0、11.8%、40.0%和74.7%，差异有统计学意义(χ2=45.017，p=0.000)。见表2、图1。表2 id-1蛋白在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达水平
2.2 id-1 mrna在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达 见表3。对36例组织标本进行实时荧光定量rt-pcr检测，得标准曲线回归系数均>0.96，标准曲线拟合满意。id-1基因扩增效率为1.97，β-actin为1.99。可见，目的基因与管家基因的扩增效率基本相同，故可采用比较阈值法计算id-1基因拷贝数。cinⅰ、cinⅱ～ⅲ和宫颈癌组织中id-1 mrna的相对表达量分别为慢性宫颈炎组的1.34倍、3.42倍和10.37倍，差异有统计学意义(p=0.003)，id-1基因表达在宫颈癌组高于癌前病变组(p<0.05)，而在慢性宫颈炎组织中的表达低于宫颈癌(p=0.031)和cinⅱ～ⅲ组织(p=0.045)。可见，随宫颈癌变程度加重id-1基因表达增加。图1 宫颈癌及其癌前病变组织中id-1蛋白的表达情况表3 id-1 mrna在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达
3 讨论
3.1 id-1的结构与功能 id-1是分化和(或)dna结合抑制因子(inhibitor of differentiation and/or dna binding，id)家族成员之一，id因子是1990年由benezra等[3]首先从小鼠红白血病(murine erythro-leukemia，mel) 细胞 cdna文库中克隆出来的。id因子属于hlh转录因子，也是迄今为止发现的惟一具有负性调控hlh基因家族功能的调控蛋白。hlh蛋白是一类具有螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix，hlh)结构域的dna结合蛋白，id因子可通过hlh结构中的α-螺旋相互作用与其他hlh家族转录因子(主要为bhlh类转录因子)结合形成二聚体，但因其结构内缺乏碱性残基区使得这种二聚体无法有效地结合到dna上，不能发挥转录因子活性，从而抑制相关基因转录，产生生物学效应。在哺乳动物细胞中已发现4种id因子，即id-1～id-4。目前对id-1的研究最多，发现其参与细胞分化调控、抑制肿瘤细胞凋亡、诱导细胞永生化、促进肿瘤血管生成等[1，4，5]，在癌症发生发展中起重要作用。而且id-1在许多上皮来源的肿瘤，如食道鳞状上皮癌[6]、子宫内膜癌[7，8]、肺癌[9]、胃癌等均有高表达，推测id-1可能参与了这类上皮源性肿瘤的发生。
3.2 id-1在宫颈癌变过程中的作用 目前，关于id-1在宫颈癌变过程中表达情况的研究国内外尚无相关报道。仅schindl等[2]利用免疫组化方法研究发现早期宫颈癌中有id-1高表达，表达阳性率为79.2%。分别采用免疫组化sp法和实时荧光定量rt-pcr从蛋白和基因水平检测了慢性宫颈炎、cinⅰ、cinⅱ～ⅲ、宫颈癌组织中id-1的表达情况。免疫组化结果显示， id-1表达阳性率与宫颈癌病变程度密切相关，在慢性宫颈炎、cinⅰ、cinⅱ～ⅲ、宫颈鳞癌组织中id-1蛋白表达阳性率呈逐渐升高趋势(p<0.01)，分别为0、11.8%、40.0%、74.7%，而且id-1的染色强度也随病变加重而加深，所有的宫颈癌及其癌前病变组织中均出现不同程度的id-1免疫阳性反应;实时荧光定量rt-pcr检测结果也从基因水平进一步证实了免疫组化的结论，即id-1mrna的表达也随宫颈癌变程度加重而增加，cinⅰ、cinⅱ～ⅲ和宫颈鳞癌组织中id-1 mrna的相对表达量分别是慢性宫颈炎组织的1.34倍、3.42倍和10.37倍，差异有统计学意义(p<0.05)。综上结果提示id-1过表达参与了宫颈癌的癌变过程，在宫颈癌的发病机制中可能起到了重要作用，但具体致癌机制有待进一步研究阐明。
流行病学和分子病毒学已有相当多资料证明，人乳头状瘤病毒(hpv)极有可能是宫颈癌的一个主要病因[10]。在持续hpv感染的基础上，由慢性宫颈炎cinⅰcinⅱ～ⅲ→宫颈浸润癌可能是大多数宫颈鳞癌的发病过程。但hpv感染并不能完全解释宫颈癌的发生，比如，前瞻性研究发现宫颈感染hpv16/18型者在1年内只有1/3发展为cin，以后也仅约15%将发展为宫颈癌，其余大部分均自行消退。可见宫颈癌的发生机制中，还存在其他hpv协同因素起重要作用。本研究结果初步显示了转录调节因子id-1与宫颈鳞状上皮癌变进展有关，推测在hpv持续感染的基础上，id-1可能与hpv e6/e7癌基因协同作用参与了宫颈鳞癌的发病机制，促进了宫颈癌变的持续恶性进展，但尚需更深入的研究证实。
细胞分化受阻引起无限增殖，导致细胞永生化是体外培养细胞恶性转化过程的第一步，也是体内肿瘤发生与发展进程的早期阶段。大量试验结果表明，id-1具有“永生化”癌基因的某些特性[11]，如抑制细胞分化、引起细胞持续增殖及血管持续新生等。id-1被认为是致癌性转化的一个重要调节因子。tang等[12]研究发现，kshv(卡波济肉瘤相关病毒) 感染人内皮细胞可诱导id-1表达增加，且内皮细胞增殖加快，提示id-l表达上调可能是细胞恶性转化的重要步骤。外源性表达id-1可通过抑制p16ink4a/rb和p53途径使细胞永生化，促进细胞不断增殖，最终形成肿瘤[4]。有研究显示，同时转染id-1和抗凋亡因子bcl-2可诱导成纤维细胞永生化[13]，仅id-1持续表达就可使皮肤上皮细胞的端粒酶活化，进而导致细胞永生化[4]。此外，id-1可以通过激活nf-κb途径抑制肿瘤细胞凋亡，通过激活mapk途径诱导癌细胞增生，促进肿瘤发生。ling等[15]的研究发现，通过基因转染上调前列腺癌lncap细胞id-1的表达，可增强nf-κb的反式激活及核转移，同时伴有下游效应因子bcl-xl和icam-1的表达上调，使肿瘤细胞凋亡受到抑制;而用反义寡核苷酸技术抑制id-1表达可抑制nf-κb的激活，使细胞对tnf-α诱导的凋亡敏感。在前列腺癌细胞lncap中id-1 的瞬间表达和稳定表达增加均可活化raf/mek1/2信号途径使癌细胞增殖明显加速，而当用mek1/2抑制剂pd098059阻断raf/mek1/2信号途径后，细胞周期s期的有丝分裂受抑制，细胞生长速度减慢，提示mapk信号途径的活化在id-1诱导的前列腺癌细胞增殖中起重要作用[16]。
总之，本研究结果表明id-1在宫颈癌发生发展中起重要作用，靶向抑制id-1基因表达可能给宫颈癌的治疗带来新的希望。深入研究id-1在宫颈癌发病机制中的作用对宫颈癌的防治研究有重要意义。
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