摘要】 目的 了解合肥地区儿童病毒性脑炎的病原构成及不同年龄组患儿临床表现差异。方法 将53例病毒性脑炎患儿根据年龄分为a组(<3岁)、b组(3岁～6岁)及c组(>6岁)3组。(1)采用pcr法检测脑脊液常见病毒核酸，包括肠道病毒(ev)、单纯疱疹病毒(hsv)、水痘带状疱疹病毒(vzv)和人巨细胞病毒(hcmv)。(2)分析不同年龄组临床表现特点。结果 (1)32例核酸检测阳性(60.38%)，其中ev 23例(43.40%)，hsv 8例(15.09%)，hcmv 1例(1.89%)，未检出vzv。(2)a、b两组中有惊厥者明显多于c组(p<0.01)，c组以头痛为早期症状者23例(85.19%)，而a、b两组分别只有1例和4例(p<0.01)。hsv脑炎惊厥发生明显多于其他病毒性脑炎。结论 证实合肥地区儿童病毒性脑炎病原以ev和hsv为主，hsv脑炎临床症状较严重，提示临床应加强病毒性脑炎病原检测工作，而pcfr检测患儿脑脊液中特异性病毒核酸片段符合临床快速、特异诊断要求。
【关键词】 脑炎，病毒性; 儿童; 聚合酶链反应
virus nucleic acid testing and clinical analysis of cerebrospinal fluid in children with viral encephalitis chen wei1, liu xiaojing2, cui huan1, xia junbao1, chen jingxian1, wang mingli1. 1.department of microbiology, school of basic medical sciences, anhui medical university, hefei 230032, china; 2.department of pediatrics, the first affiliated hospital of anhui medical university, hefei 230022, china
【abstract】 objective to comprehend the possible constitution of pathogens and disparity in clinical manifestation in children with viral encephalitis. methods (1)the dna or rna of ev, hsv, vzv and hcmv were detected by pcr in the cerebrospinal fluid (csf). (2)the clinical manifestations were analyzed among groups of different ages. results (1)the positive culture appeared in 32 of 53 cases (60.38%). among them, ev was discovered in 23 cases (43.40%), hsv in 8 cases (15.09%) and hcmv in 1 case (1.89%). vzv was not detected. (2)the convulsion in groups a and b was significantly greater than in group c (p<0.01). group c with the early symptoms of headache was 23 cases (85.19%), while a and b groups were only 4 cases and 1 case (p<0.01). hse was more than other viral encephalitis. conclusions ev and hsv might play an important role in etiological constitution of viral pathogens in children with viral encephalitis. the clinical symptoms of hse were more serious. it is suggested pathogen detection be enhanced regarding viral encephalitis, and pcr testing in the cerebrospinal fluid in children with specific virus nucleic acid fragment meet the requirement of rapid, specific diagnosis clinically.
【key words】 encephalitis, viral; child; polymerase chain reaction
病毒性脑炎(viral encephalitis，ve)是由多种病毒引起的脑和脑膜病变的总称，是儿童最常见的中枢神经系统感染性疾病之一，病因复杂，可由100多种病毒感染所致[1]。wWW.11665.coM病毒性脑炎病情轻重差异很大，轻者预后良好，重者可留有后遗症甚至导致死亡。且由不同病原引起的脑炎，其治疗、愈后也常常不同。因此，确定由何种病毒引起，对病毒性脑炎患儿有重要意义。为了解合肥地区儿童病毒性脑炎的常见病原，以进一步开展不同病毒感染所致的病毒性脑炎的诊断与防治工作，笔者采用多聚酶链反应(pcr)及逆转录多聚酶链反应(rtpcr)方法，对52例临床诊断为病毒性脑炎的患儿脑脊液(cerebrospinal fluid，csf)进行了常见病毒如肠道病毒(enterovirus,ev)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，hsv)、水痘带状疱疹病毒(varicellazoster virus，vzv)以及人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，hcmv)等的核酸检测，现将检测结果结合临床表现报告如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料 实验组为2006-2007年安徽医科大学第一附属医院儿科收治的临床诊断为病毒性脑炎、脑膜炎的患儿53例，其中男34例，女19例，年龄1个月～13岁，中位年龄6.4岁。根据儿科常用年龄阶段划分法再分为3组，其中a组15例(婴幼儿期，<3岁)，b组11例(学龄前期，3岁～6岁)，c组27例(学龄期，>6岁)。诊断均符合《实用儿科学》病毒性脑炎及脑膜炎的诊断标准[2]。正常对照组为确诊为化脓性脑膜炎或结核性脑膜炎的患儿20例，其中男12例，女8例，年龄4月～11岁，中位年龄5.9岁。
1.2 标本采集 患儿入院次日上午于第二、三腰椎间隙无菌穿刺取脑脊液3 ml，分装于两只无菌微量离心管内，一管送检常规和细菌学检查，包括涂片检查、新型隐球菌及抗酸杆菌以及普通细菌和结核杆菌培养，另一管立即置于70 ℃冻存备用。
1.3 病毒株 ev71(brcr株)、hsv1(f株)、vzv(ef株)及hcmv(ad169株)均为本室保存。上述病毒标准株作为实验研究中的阳性对照。
1.4 仪器与试剂 病毒rna/dna快速纯化试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。逆转录试剂盒购自美国promega公司。pcr检测采用biomate公司梯度pcr仪,试剂购自大连宝生物工程有限公司。所有引物均由上海生物技术工程公司合成。
1.5 实验方法
1.5.1 病毒核酸的提取 将冻存的脑脊液于4 ℃融解后置于离心机上，3 000 r/min，4 ℃离心10 min，留上清250 μl(其余上清弃去)，重悬细胞沉淀。按说明书提取病毒核酸，将得到的病毒核酸溶液分装到两只经depc水处理过的无菌微量离心管中，一管10 μl，留作rtpcr检测ev rna片段，另一管20 μl，留作pcr分别检测hsv dna、vzv dna和hcmv dna片段。
1.5.2 rtpcr检测ev rna 所用引物根据ev基因组5'端非编码区保守序列采用primer5.0软件设计，上游引物：5'tccggcccctgaatgcggctaat3'，下游引物：5'caccggatggatggccaatcca3'。将留作rtpcr的微量离心管于70 ℃温育10 min，短暂离心后置于冰上。采用逆转录试剂盒，按说明书组成20 μl逆转录体系,逆转录合成cdna。以逆转录产物cdna为模板，加pcr缓冲液、上游引物、下游引物、taqdna聚合酶，总体积25 μl，进行pcr。反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃ 60 s，52 ℃ 50 s，72 ℃ 60 s，共35个循环，72 ℃延伸10 min。pcr扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性产物为116 bp。
1.5.3 pcr检测hsv dna、hcmv dna和vzv dna 所用引物序列分别针对hsv、vzv及hcmv保守序列采用primer5.0软件设计，hsv上游引物:5'tagaattc aaatacgccttagcagaccc3'，下游引物:5'taaagcttctagtaaa aca atggctggt3';vzv上游引物:5'cacg tattttcagtcctcttca ag tg 3'，下游引物:5'ttagacgtggagttgacatcgttt3';hcmv上游引物:5'ggcgacatctgaaacatagc3',下游引物:5'tttatcctgccca accac ta3'。以留作pcr的微量离心管中病毒核酸溶液为模板，分别加pcr缓冲液、上游引物、下游引物、taqdna聚合酶，总体积25 μl，进行pcr，分别检测hsv、vzv及hcmv。pcr反应条件分别为：hsv:94 ℃预变性5 min，94 ℃ 60 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共35个循环，72 ℃延伸10 min;vzv：45 ℃预变性5 min，94 ℃ 45 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共35个循环，72 ℃延伸10 min;hcmv:94 ℃预变性5 min，94 ℃ 45 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共35个循环，72 ℃延伸10 min。扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性产物分别为346 bp、77 bp和142 bp。
1.6 统计学方法 使用spss 10.0进行统计学分析，计数资料采用χ2检验或fisher确切概率法，两两比较采用χ2分割法，p<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 rtpcr检测结果 53例病毒性脑炎、脑膜炎患儿中，23例csf中ev rna阳性(图1)，阳性检出率为43.40%。对照组20例患儿均为阴性。
2.2 pcr检测结果 53例病毒性脑炎、脑膜炎患儿中，8例csf中hsv dna阳性(图2)，阳性检出率为15.09%;1例csf中hcmv dna阳性(图3)，阳性检出率为1.89%。未检出vzv dna。对照组20例患儿均为阴性。
2.3 不同年龄组患儿脑脊液病毒核酸检测结果 a组检测出10例ev和1例hsv，b组检测出7例ev和1例hsv，c组检测出6例ev、6例hsv及1例hcmv，不同年龄组中病毒分布差异无统计学意义(p>0.05)。见表1表1 不同年龄组患儿脑脊液病毒病原
2.4 不同年龄组患儿临床表现 3组中全部患儿均有发热;绝大部分患儿有烦躁(84.91%)、嗜睡(71.70%)等表现，3组间差异无统计学意义(p>0.05);惊厥表现在3组之间有差异(p<0.01)，其中a、b两组中有惊厥者多于c组(p<0.01)，c组以头痛为早期症状者23例(85.19%)，而a、b两组分别只有1例和4例(p<0.01)。见表2。表2 不同年龄组患儿临床表现表3 不同病毒感染患儿临床表现
2.5 不同病毒感染患儿临床表现 全部患儿均有发热;不同病毒性脑炎中惊厥的发生有差异(p<0.05)，其中病原不明的病毒性脑炎患儿发生惊厥的少于ev和hsv感染组;大部分患儿均有意识障碍(75.47%)，其中70%以上表现为嗜睡，但除2例hse患儿出现昏迷外，其余病毒性脑炎患儿均未发生;绝大多数患儿都有烦躁不安、易激惹症状(84.91%);ev脑炎表现头痛有6例(26.09%)，低于hsv感染组(75.00%)和病原不明组(71.43%);只有ev 脑炎出现皮疹;而口周或咽峡粘膜疱疹则只在ev脑炎和hse中出现。见表3。
3 讨论
病毒性脑炎是儿童的常见病、多发病，病死率高，存活者易留有不同程度的后遗症。其临床表现多种多样，轻重不一。据报道全世界大约有100多种病毒可以引起病毒性脑炎[1]，主要有ev，包括脊髓灰质炎病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒和肠道病毒71型;疱疹病毒，包括hsv、vzv、eb病毒和hcmv;腺病毒;麻疹病毒;腮腺炎病毒;流行性乙型脑炎病毒以及新发的尼帕病毒和西尼病毒等。随着计划免疫接种的不断广泛和深入，常见病毒种类也逐渐发生了变化[3]，脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒及流行性乙型脑炎病毒等引起的脑炎已经很少见，而ev和hsv则成为最常见的病毒感染类型。本次研究从53例患儿脑脊液中检测到23例ev、8例hsv和1例hcmv，阳性率分别为43.40%、15.09%和1.89%，未检测到vzv。说明该地区病毒性脑炎、脑膜炎也以ev和hsv为主，与既往报道相似[4]。进一步分析表明，随年龄的增长，ev感染率逐渐降低，而hsv感染则正好相反，c组最多，有6例。但病毒在不同年龄组分布差异无统计学意义，可能与病例数较少有关。病毒的这种特定年龄分布特点的原因可能为健康儿童的肠道和呼吸道带有大量的ev,婴幼儿免疫功能发育不完善，易于侵入体内而发病，因此ev好发于婴幼儿;而hsv属获得性感染，年龄越大接触的机会越多，故hsv以年龄较大儿童多见。此外，由于目前仅能在1/3～1/4的中枢神经系统病毒感染病例中确定其致病病毒[5]，且此次只检测了目前临床较多见的几种病原，未对也可导致病毒性脑炎的诸如eb、腺病毒以及流感病毒等进行检测。故本次研究中尚有21例患儿病原不明。
肠道病毒为小rna病毒科肠道病毒属，主要由粪口途径传播，目前已发现有70多个血清型。病毒以感染胃肠道作为开始，但却很少引起胃肠道疾病，其靶器官以神经系统、肌肉和其他系统为主，引起脊髓灰质炎、脑膜炎/脑炎、心肌炎及手足口病等。20032005年，希腊病毒性脑炎、脑膜炎患者中，肠道病毒检出率为40.4%[6]。近年来亚太地区ev感染呈增多趋势[7，8]，其中不少合并脑炎、脑膜炎，并有死亡病例。我国大陆地区的ev感染也较常见[9]。故对ev感染的研究正成为热点。通过本次研究基本明确了合肥地区儿童病毒性脑炎主要病原体是ev(超过50%)，这提示研究和防治ev脑炎十分重要。但由于本次研究未能进一步对ev分型，故对不同ev类型的分布未能明确，有待今后继续研究。
人类疱疹病毒有8种，也是儿童病毒性脑炎较常见病原[10]。然而本次研究仅检测到8例hsv和1例hcmv，可能与病例数较少有关。单纯疱疹性脑炎(herpes simplex encephalitis，hse)是由hsv引起的急性中枢神经系统感染。发病急，死亡率高，缺乏特异性的临床表现，不及时治疗即使存活也常有后遗症，故早期诊断是关键[11]。hsv根据其抗原性不同被分为两型：hsv1和hsv2。hsv1感染比hsv2常见，但感染人群多为成人。hsv2则多感染新生儿和青少年。hsv1常潜伏于三叉神经半月节或脊神经节内，在各种诱因下可沿神经轴突进入脑内引起脑组织的感染，大约有10%～20%的患儿有口唇疱疹[12]。hsv2的原发感染主要在生殖系统及会阴部皮肤粘膜，可通过骶神经潜伏在骶神经节内，后沿神经上行感染脑实质引发病变。hcmv在人体内广泛潜伏存在[13],人巨细胞病毒脑炎表现多不典型,容易误诊、漏诊、延误治疗。本次发现的1例患儿，年龄为12岁，发病原因可能为某种因素造成其机体抵抗力下降，免疫功能出现紊乱、低下或处于抑制状态时，体内潜伏的hcmv再激活，经血循环侵入脑组织，引起脑细胞变性、坏死及其周围水肿，造成弥漫性脑功能障碍。
不同年龄病毒性脑炎患儿临床症状有很大不同。本文患儿共有的临床症状为发热、嗜睡和烦躁等，惊厥和头痛在各组中出现概率不同。a、b组中分别有73.33%和54.55%的患儿伴有惊厥，c组有85.19%的患儿头痛。可能是由于年幼儿无法主动表达头痛等不适症状，直至出现较重临床表现时才引起家长的注意。而年长儿在出现头痛时即能就诊，避免了惊厥等严重的神经系统症状的出现。但头痛、嗜睡等是临床常见症状，可为多种疾病表现，故易被忽略而延误治疗，造成患儿发生行为异常、学习困难等影响生活质量的后遗症[3]。因此认识所在地区病毒性脑炎患儿各年龄段的症状特点，对早期诊断、及时治疗，从而减少后遗症具有重要意义。
本次研究中，不同病毒感染引起的病毒性脑炎的临床表现有很多相似之处,但昏迷则只发生于两例hse患儿。提示病毒性脑炎中，以hse的临床症状较重，意识障碍较为突出，症状持续时间也较长，而肠道病毒脑炎则相对较轻。然而单凭症状、体征及一般检查较难确诊病原。确诊的主要依据是脑脊液的病原学诊断，病毒分离培养通常被认为是“金标准”，但脑脊液中病毒含量甚低，其病毒分离培养阳性率极低, 仅为4%[14],不但费时、费力，而且敏感性不高，远远不能满足临床要求，严重滞后于临床治疗，造成该类疾病的诊疗困难。而脑脊液和血清病毒igg抗体通常在发病后2周方可达到检测水平，且有时可能因病毒间的交叉反应而导致误诊。igm抗体属早期反应性抗体,机体在感染病毒后3～5 d即可产生，应用elisa方法在起病后1～5 d即可在血及脑脊液中测出阳性结果,是早期病原学诊断的方法之一[11]。然而临床诊断的试剂盒能够检测的病毒种类有限,且血清和脑脊液中病毒抗体igm含量低，因此igm阳性检出率较低，有文献报道脑脊液和血清中病毒igm抗体阳性率分别为41.1%和35.14%[14]。近年来，应用pcr技术直接检测脑脊液中的病毒核酸成为早期诊断病毒性脑炎的较好方法[15]。本文53例临床确诊的病毒性脑炎中，有32例在疾病的早期脑脊液病毒核酸检测阳性，阳性率为60.38%，表明pcr检测可用于病毒性脑炎的早期诊断，且能通过设计针对不同病毒的特异性引物，鉴别具体病毒种类。
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