【摘要】 目的: 构建赖型钩端螺旋体外膜蛋白lipl32基因真核表达载体并在cos7细胞中表达, 为钩端螺旋体dna疫苗的研究和开发奠定基础。方法: 从赖型钩端螺旋体017株全基因组中pcr扩增出目的基因, 双酶切构建重组质粒pcdna3.1lipl32。脂质体转染法将重组质粒转染cos7细胞, 通过rtpcr、 western blot检测目的基因的表达。结果: 成功构建了lipl32基因的真核表达载体, 并在cos7细胞中获得瞬时和稳定表达。结论: 赖型钩端螺旋体外膜蛋白lipl32基因真核表达载体能在哺乳动物细胞内表达, 为钩端螺旋体dna疫苗的应用提供了实验依据。
【关键词】 钩端螺旋体 外膜蛋白lipl32 真核表达
由致病性钩端螺旋体所引起的钩端螺旋体病（简称钩体病）是一种世界范围内广泛分布的人兽共患自然疫源性疾病, 严重危害人类健康和农牧业生产[1]。我国是钩端螺旋体病高发国家, 遍布三十多个省、 市、 自治区。近几十年来已有数次大规模的流行, 对我国农牧业生产和农民身体健康造成极大危害。尽管近年来钩端螺旋体病总体发病率和死亡率有所降低, 但是一旦自然条件发生变化（如洪灾、 地震等）, 极有可能造成局部或全面爆发流行。加上近年来流行菌群的更迭, 缺乏敏感的早期诊断方法和广谱高效的疫苗, 钩端螺旋体病仍然严重威胁着我国人民尤其是农民的健康。Www.11665.coM钩端螺旋体菌型复杂, 仅致病性钩端螺旋体就有23个血清群、 200个以上的血清型, 我国至少可以确定有26个国际新血清型, 是世界上血清群型最多的国家。而目前广泛使用的钩端螺旋体灭活疫苗诱导的免疫保护不完全, 保护时间短, 菌型间交叉免疫保护性弱。因此, 开发广谱、 高效、 持久的新型疫苗势在必行。本研究室率先在国内外进行钩端螺旋体dna疫苗的研究, 曾将钩端螺旋体内鞭毛蛋白基因制备dna疫苗, 免疫动物后发现该dna疫苗具有明显的免疫保护作用[2]。lipl32是钩端螺旋体含量最多的外膜蛋白, 在钩端螺旋体的致病、 免疫保护过程中可能起着十分重要的作用[3]。本研究即以赖型钩端螺旋体外膜蛋白lipl32基因为目的基因, 构建其真核表达载体并转染哺乳动物细胞, 旨在为钩端螺旋体dna疫苗的研究和开发奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料 钩端螺旋体017株, 本研究室常规保种并定时感染豚鼠传代以保持毒力。真核表达质粒pcdna3.1、 宿主菌e.coli dh5α、 cos7细胞本研究室保存。pcr试剂盒购于takara公司; 限制性核酸内切酶、 dna连接试剂盒及反转录试剂盒为晶美公司产品; 脂质体转染试剂、 trizol购自invitrogen公司; dna提取试剂盒、 胶回收试剂盒、 细胞可溶性蛋白提取试剂盒、 6×his单克隆抗体（mab）、 dab显色液购自tiangen公司; βactin多克隆抗体购于精博生物技术公司; 二抗（羊抗鼠igghrp及羊抗兔igghrp）为北京中衫公司产品; 其余试剂均为国产或进口分装（分析纯）。
1.2 方法
1.2.1 钩端螺旋体017株基因组的提取 参照terpstra等[4]方法并略加修改。
1.2.2 lipl32基因pcr扩增 根据genbank数据库中lipl32基因的序列设计引物, 上游和下游分别引入kpn i和ecor i的酶切序列。p1: 5′cgggtaccgaaggagagtctatgaaaaaac3′, p2: 5′gctgccgccaccgccggatccgccaccgccgcttccaccgccaccccggaattccttagtcgcgtcagaagc3′（划线部分分别是kpni和ecori酶切位点）（invitrogen公司合成）。pcr反应体系: 按takara公司primerstartmhs dna polymerase使用说明书操作。以赖型钩端螺旋体017株基因组为模板, p1、 p2为引物, 98℃变性10 s, 55℃退火5 s, 72℃ 90 s, 30个循化。取pcr产物进行80 g/l琼脂糖凝胶电泳, 胶回收试剂盒回收目的基因。
1.2.3 重组载体的构建和鉴定 将载体pcdna3.1、 lipl32基因分别用kpn i和ecor i限制性核酸内切酶双酶切后, 胶回收目的基因。按连接试剂盒说明书16℃连接4 h。转化宿主菌e.coli dh5α, 挑取阳性克隆摇菌、 提取质粒进行双酶切、 pcr鉴定, 同时将重组载体送invitrogen公司测序。空载体pcdna3.1转化e.coli dh5α方法同上。
1.2.4 转染质粒的提取 分别挑取重组成功的单克隆菌落和空载体菌落于10 ml lb培养基中37℃振荡培养过夜（amp 50 mg/l）, 次日提取质粒, 电泳鉴定及紫外分光光度法测定质粒的纯度和浓度, -20℃备用。
1.2.5 cos7细胞的复苏和培养 从液氮罐中取出细胞, 迅速解冻, 加到含100 ml/l小牛血清rpmi1640培养液中。37℃、 50 ml/l co2孵箱培养, 待细胞生长达80%汇合时, 以2.5 g/l胰酶消化传代。
1.2.6 cos7细胞的脂质体转染 将对数期生长的cos7细胞按105个/孔接种至6孔板中, 培养24～36 h至细胞生长达80%汇合时转染。按lipofectaminetm2000说明书进行。分别用rpmi1640培养液稀释重组质粒pcdna3.1lipl32、 空载体pcdna3.1和lipofectaminetm2000脂质体。将脂质体和dna混合后室温静置15 min。转染细胞用无血清的rpmi1640培养液洗涤2次, 然后逐滴加入所制备的脂质体dna混合物。重组质粒转染组和空载体转染组分别转染6孔。留1孔仅加rpmi1640培养基作空白对照。37℃、 50 ml/l co2孵箱中培养6 h后弃转染液, 加入2 ml含100 ml/l小牛血清的rpmi1640培养液继续培养48 h收获瞬时转染细胞。稳定转染细胞株的筛选参照文献[5]。将转染细胞转移至培养瓶中加入g418至浓度为800 mg/l,同时设对照（未转染过的cos7细胞）一瓶, 培养至对照组细胞大部分死亡, 将g418浓度降至400 mg/l, 继续培养至细胞80%汇合, 收获稳定转染细胞。
1.2.7 rtpcr检测lipl32基因在cos7细胞中的表达 rna的提取按照trizol法进行, 提取的rna经电泳检测后, 按反转录试剂盒说明书进行反转录。pcr体系和反应条件同1.2.2, 仅将模板换成cdna。为排除dna污染, 以重组质粒转染细胞所提rna为模板, 体系和反应条件同上做pcr扩增。同时作内参gapdh的pcr扩增。
1.2.8 western blot鉴定目的基因在cos7细胞中的表达 收获稳定转染的cos7细胞, 按细胞可溶性蛋白提取说明书操作收获细胞可溶性蛋白。将收获蛋白sdspage电泳后, 转至pvdf膜, 以加6×his mab（1∶200）为一抗; 以加羊抗鼠igghrp(1∶5000)为二抗, dab显色, 同时做βactin的对照。空载体pcdna3.1转染组western blot检测方法同上。
2 结果
2.1 赖型钩端螺旋体017株lipl32基因的pcr扩增 扩增出一特异性条带, 约810 bp（图1）。
图1 钩端螺旋体017株lipl32基因的pcr扩增（略）
fig 1 pcr product of lipl32 amplified from leptospira strain 017 genomic dna
m: dna marker; 1: product for lipl32.
2.2 lipl32真核重组质粒的构建和鉴定 挑取阳性克隆摇菌提取质粒经80 g/l琼脂糖凝胶电泳初步鉴定后, 用kpn i 和ecor i双酶切鉴定并以提取质粒为模板, p1、 p2为引物进行pcr扩增, 空载体pcdna3.1作对照。双酶切结果示该重组质粒含有一810 bp左右的片段, pcr结果示该重组质粒能扩增出目的片段, 而空载体pcdna3.1未能扩增出, 测序结果和genbank中lipl32基因序列比对, 100%匹配, 表明重组质粒构建成功(图2)。
2.3 转染质粒的提取 琼脂糖电泳显示, 大部分dna呈超螺旋构型, dna a260/280=1.8～1.9, 适合转染。
2.4 脂质体dnacos7细胞的瞬时转染和稳定株的筛选 由于脂质体对细胞有毒性, 转染后细胞有部分形态皱缩或死亡, 培养液中可见结构破坏后的碎点。加入高浓度的g418后, 转染和未转染的细胞均出现大量皱缩变性细胞, 至第5天未转染组细胞几乎全部死亡, 质粒转染组尚有活细胞存在, 降低g418浓度继续培养1周, 得到稳定转染的细胞株。
图2 lipl32基因真核重组质粒的构建及鉴定（略）
fig 2 construction and identification of the eukaryotic recombinant vector
m: dna marker; 1: plasmid pcdna3.1; 2: recombinant plasmid(pcdna3.1 lipl32); 3: plasmid pcdna3.1 digested with ecor i; 4: recombinant plasmid(pcdna3.1 lipl32) digested with ecor i; 5: recombinant plasmid digested with kpn i and ecor i ; 6: pcr product amplified from recombinant vector with primer p1 and p2; 7: pcr product amplified from plasmid pcdna3.1.
2.5 质粒转染的cos7细胞rtpcr检测 分别提取重组质粒转染组、 空载体转染组和空白对照组细胞rna, 进行rtpcr检测。结果, 重组质粒转染组能扩增出目的基因, 而空载体转染组和空白对照组均未能扩增出目的基因。同时, 以提取重组质粒转染组细胞的rna为模板进行pcr扩增也未能扩增出目的基因, 表明目的基因能在cos7细胞中表达（图3）。
图3 rtpcr检测lipl32基因在cos7细胞中的表达（略）
fig 3 expression of lipl32 gene in cos7 cell by rtpcr analysis
m: dna marker; 1: rtpcr with rna from cos7 cell with recombinant plasmid; 2: rtpcr with rna from cos7 cell with plasmid pcdna3.1; 3: rtpcr with rna from cos7 cell without transfection; 4: pcr with rna from cos7 cell with recombinant plasmid.
2.6 lipl32基因表达的western blot鉴定 重组质粒转染组western blot分析显示在mr 30000左右出现一特异性的条带, 和预期目的蛋白的mr吻合, 而空载体转染组未出现阳性条带, 表明重组质粒转染组细胞有目的蛋白的表达(图4)。
图4 重组质粒转染cos7细胞后目的蛋白表达的western blot鉴定（略）
fig 4 western blot analysis of the expressed target protein after transfection
m: protein marker; 1: recombinant plasmid transfection group(with 6×his monoclonal antibody as first antibody); 2: plasmid pcdna3.1 transfection group(with 6×his monoclonal antibody as first antibody); 3: recombinant plasmid transfection group(with βactin multiclonal antibody as first antibody); 4: pcdna3.1 transfection group(with βactin multiclonal antibody as first antibody).
3 讨论
本研究室曾将钩端螺旋体多个基因制备成钩端螺旋体dna疫苗, 免疫动物后攻击试验证明这些dna疫苗有一定的免疫保护效应, 说明应用dna疫苗预防钩端螺旋体病是可行的[2, 6]。由于钩端螺旋体血清型众多, 要研制具有广谱的dna疫苗, 必须选择在众多血清型中相对保守以及具有免疫保护性的基因。研究证明, 钩端螺旋体的外膜蛋白是钩端螺旋体的重要毒力因子, 由于其位置的特殊性, 在钩端螺旋体的黏附、 致病、 免疫保护等过程中可能起着重要作用。lipl32是钩端螺旋体中含量最多的外膜蛋白, 基因序列高度保守, 血清型之间的同源性高达93%～99%。已证明该蛋白具有增强钩端螺旋体溶血素的溶血功能, 被称为溶血素相关蛋白1（hap1, hemolysis associated protein1）[7]。2001年branger等[8]构建腺病毒lipl32重组载体并免疫沙鼠, 结果沙鼠诱导产生了强烈的交叉免疫保护效应。为了避免腺病毒潜在的安全隐患, 作者又用puc表达载体和lipl32构建重组载体对沙鼠进行dna免疫, 结果也诱导产生了交叉免疫保护效应[9]。提示由该基因构建的dna疫苗可能具有极高的开发和应用价值。本研究中即以lipl32基因为目的基因, 以pcdna3.1为载体, 构建真核重组载体。由于载体pcdna3.1含有cmv强启动子, 可以使目的基因得以有效地表达, 且其氨苄青霉素抗性基因中含有2个拷贝的免疫刺激dna 序列( immunostimulatory sequence, iss, 又称cpg dna), 该序列对dna疫苗有很强的佐剂作用, 有利于提高机体的免疫效应。转染哺乳动物细胞时, 我们选用了转染效率高、 对细胞毒性小的脂质体转染法。转染细胞后通过g418压力筛选得到了稳定转染株, 有利于下一步对目的基因表达的鉴定。转染后的基因表达与否, 取决于表达的载体、 宿主细胞及目的蛋白的性质等。通过rtpcr和western blot检测可分别从转录和翻译水平对目的基因的表达进行检测。本研究中通过rtpcr检测发现lipl32基因可以在cos7细胞中有效表达。另外, 在设计引物时, 我们去掉了lipl32基因的终止密码, 使得pcdna3.1载体中的6个组氨酸得到表达, 有利于western blot分析时用6个组氨酸标签蛋白的mab进行检测, 提高了检测的特异性和敏感性。通过western blot鉴定发现, 在mr 30000左右有一特异性的阳性条带, 和预期目的蛋白的mr吻合, 而在对照组未出现目的条带, 表明目的基因在细胞中得到了表达。
综上所述, 我们成功地构建了赖型钩端螺旋体外膜蛋白lipl32基因真核表达载体并转染哺乳动物细胞, 通过rtpcr和western blot检测证实目的基因能在哺乳动物细胞中表达, 为下一步进行动物试验奠定了基础。
【参考文献】
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