作者：王瑞，刘晓燕，马立志，高蓬明，徐洪
【摘要】 目的通过均匀设计法优选八爪金龙半仿生提取工艺条件，并对其提取物的抑菌活性进行研究。方法以岩白菜素含量、hplc总面积、干浸膏得率为指标，进行综合评判，并将3种工艺提取物的抑菌活性进行比较。结果最佳半仿生提取工艺为八爪金龙加8倍、8倍、6倍水提取3次，3次煎水ph值分别为2.0，6.5，9.0；提取时间依次为85，40，20 min。综合评价y值及抑菌活性顺序为：醇提取法>半仿生提取法>水提法。结论优选出的半仿生工艺是可行的，且优于水提工艺。
【关键词】 八爪金龙；半仿生提取；工艺条件；抑菌活性
abstract：objectiveto obtain the best extraction condition of semi-bionic for ardisia crenata sims by uniform design and study its antibacterial activity.methodsthe semi-bionic extraction (sbe) conditions were optimized by comprehensive evaluation with the content of bergenin, total hplc integrate area and dried extract weight were adopted as markers. the antibacterial activities of extracts from three different processes were investigated. resultsthe ardisia crenata sims was extracted in water 8, 8, 6 times as much as it for 3 times; the ph values of the water for the thrice extraction were 2.0, 6.5, 9.0; the extraction time were 85, 40, 20 min. the order of comprehensive evaluation value and antibacterial activities was as follows: ae, sbe, we.
conclusionoptimization of sbe method of ardisia crenata sims by uniform design is available and better than we method.
key words：ardisia crenata sims; semi-bionic extraction method; process conditions; antibacterial activities
八爪金龙，被苗族奉为喉科良药，为紫金牛科植物朱砂根ardisia crenata sims的干燥根及根茎, 具清热解毒、散瘀止痛、祛风除湿之功能, 用于治疗咽喉肿痛、扁桃体炎、心胃气痛、劳伤吐血、跌扑损伤、风湿骨痛［1］。wWw.11665.Com该药材在贵州省分布广、蕴藏量大，为贵州民间习用中药。有关文献报道，该药材提取物—岩白菜素及其衍生物对白血细胞、肺癌细胞、口腔上皮癌细胞、宫颈瘤、肝h22肿瘤等具有明显抑制作用［2］及良好的抗hiv病毒作用［3］；所含三萜总皂苷具有抑制血小板凝聚作用［4］；环苯缩酚酸肽具有降低血压作用［5］。
半仿生提取法(semi-bionic extraction method，简称sbe法)已在单方和复方制剂工艺中得到一定应用，其结果表明该技术符合口服药物经胃肠道转运吸收的原理，该工艺提取物更接近药物在体内达到平衡后的有效成分群，有可能替代传统的中药提取技术［6］。本研究通过均匀设计法，以岩白菜素含量、hplc总面积、干浸膏得率为综合评判指标，优选出八爪金龙sbe工艺条件，并将其sbe工艺产物与醇提法产物、水提法产物进行综合评判指标及抑菌活性对比。
1 仪器与材料
高效液相色谱仪(agilent 1100高效液相色谱仪、二极管阵列检测器、原装色谱工作站)；色谱柱：diamonsiltm(钻石)c18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm)；phs2-3c型精密ph计(上海雷磁仪器厂)；auw220d电子分析天平(岛津)；re-52a型旋转蒸发仪(上海亚荣)；es-315 tomy高压蒸气灭菌锅(基因公司)；bcn-1360b生物洁净工作台(广东半球仪器厂)；gnp-9000系列生化培养箱(嘉兴中新医疗仪器公司)。
八爪金龙样品于2006-12采集于贵阳市乌当区，经贵阳学院生物教研室高蓬明副教授鉴定为紫金牛科朱砂根ardisia crenata sims植物，规范炮制。岩白菜素标准品(中国药品生物制品检定所，批号为：111532-2002-02)；甲醇(美国tedia公司，色谱纯)；水为娃哈哈纯净水；大肠杆菌(escherichia coli.)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(staphylococus aureus)由贵州大学生命科学院提供。抑菌活性实验中所使用培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。其余试剂均为分析纯。
2 方法
2.1 分析方法确立
2.1.1 干浸膏得率干浸膏得率（%）=干浸膏质量八爪金龙粉末质量×100%
2.1.2 岩白菜素含量测定
色谱条件［7］：色谱柱为diamonsiltm(钻石)c18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相为甲醇-水(25∶75)，检测波长275 nm，流速1 ml·min-1。每次进样之前用流动相平衡10 min。按该色谱条件下理论板数以岩白菜素峰计算不低于2 900，分离度不低于1.5。对照品及样品谱图见图1～4。
对照品溶液及标准曲线的制备：精密称取岩白菜素对照品并用甲醇溶解、配成1.0 mg/ml的对照品溶液。将对照品溶液依次配成0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/ml的混合溶液。依次精密吸取10 μl进行分析。以岩白菜素的进样量(μg)为横坐标, 峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程：y= 54.34x +1.65，(r=0.999 2)，表明岩白菜素的进样量在0.5～10 μg成良好线性关系。
样品溶液的制备：精密称取八爪金龙样品0.1 g，置具塞锥形瓶中, 精密加入甲醇25 ml , 称定重量，超声处理30 min，放冷，用甲醇补足重量，摇匀，微孔滤膜(0.45 μm)过滤，即得，避光保存。
精密度实验：精密吸取质量浓度为1.0 mg/ml的对照品溶液10 μl，重复进样5次，rsd为1.97 % (n=5)，表明精密度较好。
稳定性实验：取同一份样品溶液，分别在0，4，8，10 h进样，岩白菜素含量rsd为2.16 %，表明样品至少在10 h内稳定。
重复性实验：取同一份样品，精密称量，按“样品溶液的制备”方法制备样品溶液5份，分别进样，测定岩白菜素含量，rsd分别为2.24 % (n=5)，表明重复性良好。
2.2 八爪金龙不同工艺提取物的制备
2.2.1 水提(water extraction method, we)法产物的制备称取八爪金龙粗粉30 g两份，进行平行实验，加入其质量8，8，6倍水，依次加热回流3次，2 h/次。提取液用6层纱布过滤，滤液经离心处理(2 000 r·min-1，20 min)，合并滤液并经旋转蒸发仪蒸发浓缩，再放入真空干燥箱(60℃)内制成干浸膏，称重，置于干燥器皿内备用，按“2.1.1”项法计算干浸膏得率及测定提取物中岩白菜素含量。
2.2.2 醇提法(alcohol extraction method, ae)产物的制备依次使用8，8，6倍乙醇对30 g八爪金龙粗粉回流浸提，2 h/次，其余处理同上。
23 sbe工艺的均匀设计优选及结果
2.3.1 实验设计与安排根据sbe理论方法［6］，在药材粒度、煎煮加水量(8，8，6倍)、煎煮温度及次数、过滤、浓缩等条件相同的前提下，确定考察的因素和水平。根据预实验的结果及仿生学原理，人体胃、小肠、大肠的体液酸度最佳ph分别为2.0，7.5，8.3，以岩白菜素、干浸膏得率的标准化处理结果为考察指标，使用数理统计软件dps 7.55安排混合水平均匀设计表［u9(9×33)，中心化偏差cd=0.2072］安排实验(见表1)。其结果及数据分析(见表2)。每次称取30 g八爪金龙粗粉两份，其余处理同上。表1 u9(9×33)混合水平均匀设计（略）表2 sbe工艺提取物各指标成分含量及标准化处理结果（略）
2.3.2 工艺条件的优化为体现中药多成分、多途径、多靶点的作用特点［8］，以岩白菜素含量、hplc总面积、干浸膏得率为指标，按公式x’i.j=(xi.j-j)/sj进行标准化处理［9］。xi.j为样品中成分j的含量， j为9个水平样品液成分j的标准差， sj为9个不同水平样品成分j的标准差。xi.j为标准化值。根据各指标在提取工艺中的主次地位，给予不同的加权系数，以标准化值 加权后求和后得综合评价y值(y = 岩白菜素含量 × 7 + 干浸膏得率× 2 + hplc总面积 × 1)，并将y值经dps 7.55进行逐步回归分析，(见表2)。将表2内y值(综合评判指标)进行线性回归处理，得回归方程：y= -1 001.641 2 - 54.078 0x1 + 284.699 6x2 + 25.334 3x3 - 22.027 3x2 x2 + 12.149 1x1 x2 - 4.012 6x1 x3 - 1.875 4x2 x3，理论最大优化值为y= 14.12。模型的复相关系数r=0.999 6，f=7 520.078 9，而f0.01(4, 4)＝15.98，因此该方程在α=0.01的水平上显著。因此，用该模型预测的工艺参数对八爪金龙的半仿生提取的影响是可行的。由方程得到的最优提取工艺条件是：第1,2,3次煎水ph值分别为2.02,6.54,9.00，总煎提时间为2.35 h。结合生产实际，确定其工艺条件为：第1次煎水用hcl调至2.0；第2,3次煎水ph分别为6.50，9.00；煎提总时间2.35 h，即依次为85，40，20 min。
2.3.3 优化条件验证分别取150 g八爪金龙粗粉3批，按优化后的条件进行提取，测得平均岩白菜素含量为10.87 mg/g，rsd：3.39%；平均hplc总面积5 949，rsd：4.63 %；平均干浸膏得率32.37 %，rsd：4.94 %；y=14.36，与回归模型预测值较为接近。
2.3.4 抑菌活性研究(杯碟法)
供试样品的制备：取3种工艺提取物分别稀释成一定浓度梯度的水溶液(见表3)，备用。
培养基与菌种液的制备：培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，琼脂粉15 g，nac1 5 g，葡萄糖5 g，蒸馏水1 000 ml，ph 7.2。
菌种液：将菌种进行斜面活化3次后，于培养基斜面37℃培养24 h。用接种环挑取具有代表性菌体于肉汤培养基中混匀、37 ℃培养24 h，取出作为原菌液。再用无菌生理盐水稀释，振荡几分种，调整菌浓度约为105 ～106 cfu/ml。
抑菌圈的测定：采用杯碟法比较八爪金龙不同工艺提取物的抑菌活性。取牛津杯(id = 0.6 cm)，高压灭菌，37 ℃培养24 h。蒸馏水为空白对照，每样品重复两次，测量抑菌圈直径，取平均值。结果见表3。表3 不同工艺提取物对金色葡萄球菌、大肠杆菌、（略）
3 结论
对3种工艺的岩白菜素含量、hplc总面积及干浸膏得率进行标准化处理并对综合评价指标进行比较 (表4)， ae法所得产物各项指标最优，而sbe法的综合评判指标较we法更为接近ae法。八爪金龙提取物对金色葡萄球菌具有明显抑菌活性，大肠杆菌次之(表3)，3种工艺提取物对以上两种菌的抑菌活性顺序为：ae>sbe>we。而sbe、we法提取物对枯草芽孢杆菌略高于ae法，结合hplc谱图(图2～4)，推测为不同溶剂对有效成分的浸出选择性差异所致。表４ 不同提取物各指标成分的含量及标准化处理结果（略）
本文首先对八爪金龙半仿生提取工艺的优选，并将最佳工艺产物与醇提法、水提法产物的岩白菜素含量、hplc总面积、干浸膏得率的综合评价指标及抑菌活性进行了比较。相对于传统水提工艺，半仿生提取工艺可有效降低浸膏得率，较传统水提工艺为佳。
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