作者：徐世芬，庄礼兴，唐纯志
【摘要】 【目的】观察针刺对抑郁模型大鼠海马脑源性神经营养因子(bdnf)和神经生长因子(ngf)表达的影响，探讨针刺的抗抑郁机制。【方法】选用sd大鼠随机分为正常组、模型组、针刺组、西药组，应用孤养和长期不可预见的慢性应激刺激复制抑郁大鼠模型，同时西药组按2 mg·kg-1·d-1剂量给予氟西汀灌胃，针刺组予以针刺百会、心俞、肝俞穴，每天1次，共21 d。采用免疫组化方法检测各组大鼠海马bdnf和ngf蛋白表达的情况。【结果】与正常组比较，模型组bdnf和ngf阳性细胞数量显著减少(p<001)，而针刺组、西药组bdnf和ngf阳性细胞数显著增加(与模型组比较，p<005)。【结论】针刺可以增加抑郁大鼠海马bdnf 与ngf 表达，这可能是针刺抗抑郁的分子机制之一。
【关键词】 抑郁症/针灸疗法;海马/病理学;神经营养因子;神经生长因子;疾病模型，动物;大鼠
研究表明，抑郁症的发病机制及治疗可能涉及神经元可塑性的假说，神经元可塑性失调可导致抑郁症[1]。神经生长因子(nerve growth factor,ngf)与脑源性神经营养因子(brainderived neurotrophic factor,bdnf)是神经因子家族的两个成员，在神经系统的生长发育中有重要作用，对神经元的可塑性及其形成和生存起着重要的调节作用[2]。Www.11665.com本研究采用孤养和长期不可预见的慢性应激刺激复制抑郁大鼠模型，观察针刺对模型大鼠海马神经元bdnf和ngf表达的影响，现报道如下。
1材料与方法
11实验动物和分组spf级成年sd大鼠，体质量220～290 g，雌雄各半。由广州中医药大学动物中心提供，实验动物合格证编号：2007a017。首先采用openfield法[3]作行为学评分，选择得分相近的32只大鼠，适应性喂养7 d后，随机分为正常组、模型组、氟西汀组(西药组)、针刺组，每组8只。正常组每笼饲养4只，雌雄分开。用普通大鼠饲料喂养，饮用自来水，室温控制在20℃～25℃，湿度60%～80%。实验在广州中医药大学动物实验中心进行(合格证编号：0007047)。
12试剂与仪器bdnf、ngf免疫组化试剂盒购自中山生物试剂有限公司广州分公司。33’二氨基联苯胺四盐酸盐(dab)显色剂，兔抗ngf和bdnf多克隆抗体：一抗(工作浓度为1∶100)、二抗、三抗，40 g/l多聚甲醛，磷酸盐缓冲液(pbs)均购自武汉博士德生物有限公司。cx21bimset生物显微镜(olympus公司生产)，图像分析仪(北京航空航天大学24版本)。
13动物模型的复制按照参考文献方法[3]进行抑郁症模型大鼠的复制。模型组、针刺组、西药组每笼饲养1只，各组分别接受21 d各种不同的应激刺激，包括断水24 h;断食24 h;夹尾1 min;4℃冰水游泳5 min;摇晃：1次/s，5 min;昼夜颠倒;电击足底，电压50 mv，每5 s刺激1次，间歇5 s，共刺激10次。每天随机选择1种刺激，每种刺激平均使用3次，共21 d。
14治疗方法给予大鼠各种不可预知的应激刺激同时，西药组按照2 mg·kg-1·d-1剂量给予盐酸氟西汀(美国礼来公司)，将药物溶于生理盐水中灌胃，每天1次。针刺组每天应激刺激前1 h进行治疗，根据《实验针灸学》[4]大鼠穴位定位方法取穴，选取百会、心俞、肝俞。穴位常规消毒，选用华佗牌025 mm×13 mm针灸针进行针刺。百会向尾部斜刺，进针深度约为2 mm，心俞、肝俞(左右两侧穴位交替使用，每次取单侧)斜刺5 mm，每穴均匀捻转刺激30 s，留针15 min。每天1次，共21次。
15检测指标和方法
151取材方法各组大鼠在治疗21 d结束后，全部断头取脑，剥离全脑，于冰浴下迅速分离出海马，40 g/l多聚甲醛固定6 h，再依次浸入200、300 g/l的蔗糖pbs(ph 72)中，直至组织块下降到底部，恒冷冰冻切片机连续冠状切片，取海马与齿状回互包平面，片厚40 μm，直接置于01 mmol/l pbs液中，4℃冰箱保存。
152bdnf、ngf免疫组织化学染色载玻片经防脱片剂polylysine处理，体积分数3%h2o2室温作用10 min以灭活内源性酶，蒸馏水洗3次。热修复抗原：将切片浸入001mol/l枸橼酸盐缓冲液(ph 60), 微波炉加热至沸腾后断电，间隔5～10 min，反复1～2次。冷却后pbs(ph 72～76)洗涤2次，加50 mg/l的牛血清白蛋白(bsa)封闭液，室温20 min。甩去多余液体，不洗，滴加1∶100稀释的一抗(抗bdnf、ngf)，37℃放置1 h。pbs洗涤2 min×3次，滴加生物素化山羊抗小鼠igg，37℃、20 min。pbs洗涤2min×3次，滴加链霉亲和素—生物素—过氧化物酶连结法(sabc)试剂，37℃、20 min。pbs洗涤5 min×4次，使用dab显色试剂显色。取1 ml蒸馏水，加入试剂盒中abc试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5～30 min之间。蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染。脱水，透明，封片，显微镜观察。每组各取1张切片贴在载玻片上，通过比较吸光度(d)半定量分析bdnf和ngf的表达量。每张随机取2个视野，在10×40光镜下用图像分析仪进行分析。
16统计学方法采用spss 120软件分析数据，用单因素方差分析：方差齐时采用lsd法(最小显著差异法);方差不齐时采用dunnett t3法。
2结果
正常组大鼠海马结构中，bdnf阳性细胞表达很强，广泛分布于海马的锥体细胞和齿状回的颗粒细胞层，细胞排列密集，着色深，有的有较长的突起。与正常组比较，模型组bdnf阳性细胞数量明显减少，且多数细胞呈空泡状，胞浆着色较浅。针刺组、西药组bdnf阳性细胞数显著增加(与模型组比较，p<005)，但两组间比较，差异无显著性意义(p>005)。结果见表1、图1(见彩图页第615页)。
正常组大鼠海马神经元中可见较多的ngf免疫反应阳性颗粒，呈浅棕色。与正常组比较，模型组大鼠海马神经元ngf 阳性细胞数显著减少(p<001)，着色浅淡。针刺组、西药组与模型组比较，ngf 阳性细胞数显著增加(p<005)，但两组间比较，差异无显著性意义(p>005)。结果见表1、图2(见彩图页第615页)。表1各组大鼠海马bdnf和ngf阳性神经元的吸光度比较x
【摘要】 【目的】观察针刺对抑郁模型大鼠海马脑源性神经营养因子(bdnf)和神经生长因子(ngf)表达的影响，探讨针刺的抗抑郁机制。【方法】选用sd大鼠随机分为正常组、模型组、针刺组、西药组，应用孤养和长期不可预见的慢性应激刺激复制抑郁大鼠模型，同时西药组按2 mg·kg-1·d-1剂量给予氟西汀灌胃，针刺组予以针刺百会、心俞、肝俞穴，每天1次，共21 d。采用免疫组化方法检测各组大鼠海马bdnf和ngf蛋白表达的情况。【结果】与正常组比较，模型组bdnf和ngf阳性细胞数量显著减少(p<001)，而针刺组、西药组bdnf和ngf阳性细胞数显著增加(与模型组比较，p<005)。【结论】针刺可以增加抑郁大鼠海马bdnf 与ngf 表达，这可能是针刺抗抑郁的分子机制之一。
【关键词】 抑郁症/针灸疗法;海马/病理学;神经营养因子;神经生长因子;疾病模型，动物;大鼠
研究表明，抑郁症的发病机制及治疗可能涉及神经元可塑性的假说，神经元可塑性失调可导致抑郁症[1]。神经生长因子(nerve growth factor,ngf)与脑源性神经营养因子(brainderived neurotrophic factor,bdnf)是神经因子家族的两个成员，在神经系统的生长发育中有重要作用，对神经元的可塑性及其形成和生存起着重要的调节作用[2]。本研究采用孤养和长期不可预见的慢性应激刺激复制抑郁大鼠模型，观察针刺对模型大鼠海马神经元bdnf和ngf表达的影响，现报道如下。
1材料与方法
11实验动物和分组spf级成年sd大鼠，体质量220～290 g，雌雄各半。由广州中医药大学动物中心提供，实验动物合格证编号：2007a017。首先采用openfield法[3]作行为学评分，选择得分相近的32只大鼠，适应性喂养7 d后，随机分为正常组、模型组、氟西汀组(西药组)、针刺组，每组8只。正常组每笼饲养4只，雌雄分开。用普通大鼠饲料喂养，饮用自来水，室温控制在20℃～25℃，湿度60%～80%。实验在广州中医药大学动物实验中心进行(合格证编号：0007047)。
12试剂与仪器bdnf、ngf免疫组化试剂盒购自中山生物试剂有限公司广州分公司。33’二氨基联苯胺四盐酸盐(dab)显色剂，兔抗ngf和bdnf多克隆抗体：一抗(工作浓度为1∶100)、二抗、三抗，40 g/l多聚甲醛，磷酸盐缓冲液(pbs)均购自武汉博士德生物有限公司。cx21bimset生物显微镜(olympus公司生产)，图像分析仪(北京航空航天大学24版本)。
13动物模型的复制按照参考文献方法[3]进行抑郁症模型大鼠的复制。模型组、针刺组、西药组每笼饲养1只，各组分别接受21 d各种不同的应激刺激，包括断水24 h;断食24 h;夹尾1 min;4℃冰水游泳5 min;摇晃：1次/s，5 min;昼夜颠倒;电击足底，电压50 mv，每5 s刺激1次，间歇5 s，共刺激10次。每天随机选择1种刺激，每种刺激平均使用3次，共21 d。
14治疗方法给予大鼠各种不可预知的应激刺激同时，西药组按照2 mg·kg-1·d-1剂量给予盐酸氟西汀(美国礼来公司)，将药物溶于生理盐水中灌胃，每天1次。针刺组每天应激刺激前1 h进行治疗，根据《实验针灸学》[4]大鼠穴位定位方法取穴，选取百会、心俞、肝俞。穴位常规消毒，选用华佗牌025 mm×13 mm针灸针进行针刺。百会向尾部斜刺，进针深度约为2 mm，心俞、肝俞(左右两侧穴位交替使用，每次取单侧)斜刺5 mm，每穴均匀捻转刺激30 s，留针15 min。每天1次，共21次。
15检测指标和方法
151取材方法各组大鼠在治疗21 d结束后，全部断头取脑，剥离全脑，于冰浴下迅速分离出海马，40 g/l多聚甲醛固定6 h，再依次浸入200、300 g/l的蔗糖pbs(ph 72)中，直至组织块下降到底部，恒冷冰冻切片机连续冠状切片，取海马与齿状回互包平面，片厚40 μm，直接置于01 mmol/l pbs液中，4℃冰箱保存。
152bdnf、ngf免疫组织化学染色载玻片经防脱片剂polylysine处理，体积分数3%h2o2室温作用10 min以灭活内源性酶，蒸馏水洗3次。热修复抗原：将切片浸入001mol/l枸橼酸盐缓冲液(ph 60), 微波炉加热至沸腾后断电，间隔5～10 min，反复1～2次。冷却后pbs(ph 72～76)洗涤2次，加50 mg/l的牛血清白蛋白(bsa)封闭液，室温20 min。甩去多余液体，不洗，滴加1∶100稀释的一抗(抗bdnf、ngf)，37℃放置1 h。pbs洗涤2 min×3次，滴加生物素化山羊抗小鼠igg，37℃、20 min。pbs洗涤2min×3次，滴加链霉亲和素—生物素—过氧化物酶连结法(sabc)试剂，37℃、20 min。pbs洗涤5 min×4次，使用dab显色试剂显色。取1 ml蒸馏水，加入试剂盒中abc试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5～30 min之间。蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染。脱水，透明，封片，显微镜观察。每组各取1张切片贴在载玻片上，通过比较吸光度(d)半定量分析bdnf和ngf的表达量。每张随机取2个视野，在10×40光镜下用图像分析仪进行分析。
16统计学方法采用spss 120软件分析数据，用单因素方差分析：方差齐时采用lsd法(最小显著差异法);方差不齐时采用dunnett t3法。
2结果
正常组大鼠海马结构中，bdnf阳性细胞表达很强，广泛分布于海马的锥体细胞和齿状回的颗粒细胞层，细胞排列密集，着色深，有的有较长的突起。与正常组比较，模型组bdnf阳性细胞数量明显减少，且多数细胞呈空泡状，胞浆着色较浅。针刺组、西药组bdnf阳性细胞数显著增加(与模型组比较，p<005)，但两组间比较，差异无显著性意义(p>005)。结果见表1、图1(见彩图页第615页)。
正常组大鼠海马神经元中可见较多的ngf免疫反应阳性颗粒，呈浅棕色。与正常组比较，模型组大鼠海马神经元ngf 阳性细胞数显著减少(p<001)，着色浅淡。针刺组、西药组与模型组比较，ngf 阳性细胞数显著增加(p<005)，但两组间比较，差异无显著性意义(p>005)。结果见表1、图2(见彩图页第615页)。表1各组大鼠海马bdnf和ngf阳性神经元的吸光度比较
3讨论
海马是边缘系统重要组成部分，参与情绪、学习、记忆、行为、免疫等调节，它的损伤在各种应激所致疾患中起关键作用。应激所致的海马树突结构重建、神经元形成的减少和细胞生存能力的下降为抑郁症患者海马损害提供了细胞学基础[5]。ngf和bdnf是神经生长因子家族的两个成员，其作用比较广泛，胚胎发育期对神经系统的发育、分化、成熟以及突触的形成不可缺少，成年期对神经功能的调节和神经系统的可塑性具有重要作用[6]。成熟的神经元对刺激具有调节其结构和功能的能力，称为可塑性。bdnf可能是作为这种结构可塑性的分子媒介。有人认为，ngf可调节神经元的结构，bdnf可调节神经元的活性，其机制可能是改变了胆碱能神经元的功能，进而调节了海马神经元的可塑性[7]。
研究表明，海马是成年大鼠神经生长因子含量最高的部位，各种应激造成海马神经元损害时，ngf和bdnf也会发生变化。如束缚应激可以使大鼠齿状回的ngf降低到正常的36%，bdnf也会同时降低[8]。心理及物理应激能下降海马bdnf mrna水平，提示与应激相关的抑郁症与海马bdnf有密切关系。本实验也发现：正常组大鼠海马结构中，bdnf阳性细胞表达较强，广泛分布于海马的锥体细胞和齿状回的颗粒细胞层，细胞排列密集，着色深，有的有较长的突起。而模型组bdnf阳性细胞数量显著减少，且多数细胞呈空泡状，胞浆着色较浅。正常组大鼠海马神经元中可见较多的ngf免疫反应阳性颗粒，呈浅棕色,而模型组ngf 阳性细胞数显著减少(p<001)，着色浅淡，说明抑郁模型大鼠海马神经元的损伤与bdnf和ngf下调有密切关系。
本实验结果还显示：在给予针刺及氟西汀干预后，bdnf和ngf 阳性细胞数均较模型组显著增加。针刺可以促进bdnf和ngf 表达，从而对海马神经元的可塑性进行调节，这可能是针刺抗抑郁的分子机制之一。
抑郁症属中医的“郁病”, 主要病机为肝郁气滞、心脾两虚和肝肾阴虚。其病位在脑，涉及肝、心等，故选择百会、肝俞、心俞穴。百会属督脉，督脉是人体诸阳经脉之总汇，对整个经脉系统有统帅作用，其主干行于脊里，向上行至项后风府进入脑内，上循巅顶，故督脉与脑、脊髓关系相当密切，历代医家素有“病变在脑，首取督脉”之说。百会为手足三阳经与督脉及足厥阴肝经之会，位居头之巅顶，犹天之极星居北，为百脉聚会之处，是调补中气、疏通脑络、健脑宁神之要穴。心俞、肝俞为背俞穴，属足太阳膀胱经，其主干从头顶入里络于脑，故和脑的关系极为密切，两穴除了调理心脾、疏肝理气之外，还可健脑安神，是治疗神志病的要穴，三穴共奏解郁调神的功效。
【参考文献】
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