作者：枟涛 秦书俭 王超 任广达 裴丹

【摘要】  目的 探讨年龄因素对脂肪干细胞成骨分化能力的影响。方法 通过密度梯度离心法分离不同年龄段adscs进行培养及传代，观察细胞生长情况，细胞培养至第3代进行诱导分化，各年龄组细胞均在成骨诱导分化后进行检测。观察其形态变化、细胞凋亡率、碱性磷酸酶活性及钙离子浓度测定。结果 体外培养的adscs呈梭形，诱导条件下，各年龄组细胞形态由梭形变为立方形、多角形；经检测，随年龄的增长细胞的凋亡率在不断增大，幼年组细胞碱性磷酸酶活性较老年组高，钙离子浓度随年龄增加而降低。结论 adscs成骨分化能力随着年龄的增加而降低。

【关键词】  组织工程 脂肪干细胞 年龄 成骨分化

种子细胞的选择是骨组织工程的基础和关键之一。骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal stem cells. bmscs）作为骨组织工程种子细胞已经广泛应用。但骨髓采集量有限，大量抽取会增加机体损伤，并有一定并发症[1]，因此不利于临床大规模的培养与应用。2001年zuk等[2]通过脂肪抽吸术获得脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, adscs)。WWW.11665.COmadscs具有来源丰富、易于获取[3]、自体移植可以避免排斥反应、并且具有分化为多种中胚层来源细胞[4]及跨胚层分化[5]等优点，大量研究证实adscs在体外培养可以稳定增殖和传代并具有向成骨细胞系分化的能力[6,7]，但是不同年龄段adscs的生物学性状不尽相同，若adscs成为骨组织工程中理想的种子细胞还应考虑到，年龄因素对细胞增殖及成骨能力的影响，本研究探讨不同年龄阶段adscs的成骨分化能力及其机制。为adscs是否可以成为理想的种子细胞及为临床应用提供依据。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物及分组

    健康sd大鼠30只，雌雄不限，按年龄分为幼年组（1月龄）、成年组（12月龄）和老年组（24月龄），每组10只，体重分别约为150、400和750 g。

    1.2  主要试剂

    dmem (gibco)，胎牛血清(gibco)，ⅰ型胶原酶(sigma)，β—甘油磷酸钠(sigma)，地塞米松，抗坏血酸，alp试剂盒(南京建成)，钙含量测定试剂盒(sigma)。

    1.3  不同年龄段adscs分离培养

    取sd大鼠，脱颈处死，75%乙醇消毒，无菌条件下取腹股沟部及肾下脂肪组织，去除肉眼可见的血管及其它组织，用pbs反复冲洗3次，将脂肪组织剪成大约1 mm3小块，置0.1%ⅰ型胶原酶中，37 ℃摇床100 r/ min消化60 min，然后1 000 r/min，离心10 min，弃去上层脂滴及上清，沉淀用含10%胎牛血清的dmem培养基制成单细胞悬液。进行细胞计数，以2 × 105/ml的密度接种于培养瓶中，置37 ℃、5%co2、饱和湿度的恒温培养箱中常规培养。原代培养每3天换液。待细胞融合达80%时，吸除原代细胞培养液，加入2 ml 0.125%胰酶-edta消化液消化。当观察到细胞突起回缩，形态变圆，细胞间隙增大时，加入2 ml含10%胎牛血清的dmem中和胰酶的消化作用，用吸管反复吹打，制成单细胞悬液，移入离心管中；1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入7 ml含10%胎牛血清的dmem培养基，吹打制成均匀的细胞悬液，之后1:2传代、扩增培养。

    1.4  不同年龄段adscs成骨能力检测

    1.4.1  adscs成骨诱导培养  取第3代细胞经消化后加入含有0.1 μmol/l地塞米松、10 mmol/l β-甘油磷酸钠、50 μmol/l抗坏血酸的成骨诱导剂的dmem培养基，每3天换液。以加入不含诱导剂培养基的3代细胞作为对照组。

    1.4.2  细胞凋亡率检测  将成骨诱导14 d的细胞用0.125%胰蛋白酶-0.01%edta消化液消化，调整细胞密度密度为1 × 106/ml,取1 ml细胞，1 000 rpm离心10 min，弃上清。加入1 ml预冷的pbs震荡重悬，1 000 rpm离心10 min，弃上清。将细胞重悬于200 μl binding buffer，加入10 μl annexin v-fitc和5 ul pi，混匀，室温避光反应15 min，加入300 μl binding buffer，上机检测。

    1.4.3  碱性磷酸酶(alp)活性测定  将第3代细胞以1 × 104/孔的密度接种到24孔板。分别在诱导4、8、12、16、20 d，每次各年龄组及对照组各取6孔，按alp试剂盒要求检测alp活性。在520 nm波长处测定各孔吸光度并根据公式计算alp含量，结果表示为金氏单位u/100 ml。

    1.4.4  钙离子浓度测定  取成骨诱导7、14、21 d细胞各1板，用pbs洗两遍，每孔加入l ml 0.5 mol/l hci，振荡过夜，次日以1 000 rpm离心10 min，上清液用钙试剂盒测定钙含量。每份上清液取20 μl，按试剂盒说明进行操作，于575 nm波长处测吸光度值，结果表示为μg/孔。

    1.5  统计学分析

    采用spss13.0进行统计处理。所有数据采用x±s表示。组间比较采用单因素方差分析及q检验。方差不齐组经数据转换后再进行方差分析。

    2  结    果

    2.1  细胞形态学观察

    不同年龄阶段大鼠的adscs接种后在悬液中细胞呈圆形，不能辨认细胞核。各组在原代培养48 h，可见多数细胞贴壁，细胞呈星形，胞体较小。培养第5天，各组细胞形态无差别均呈梭形，幼年组细胞胞体较小，数量多，形成集落明显，克隆性生长(图1)；成年组细胞数量较多，克隆性生长(图2)；老年组细胞胞体稍大，数量少，散在分布(图3)。细胞增殖速度随年龄的增加而降低，幼年组原代培养第5天细胞达到80%融合可进行首次传代，老年组细胞则需要8 d。传代培养的adscs生长模式与原代培养细胞相似呈梭形，但细胞增殖速度比原代培养明显加快，幼年组此后平均3 d传代1次，老年组平均5 d传代1次。细胞成骨诱导后较普通培养基所培养的细胞生长缓慢，4 d后细胞形态由梭形变为立方形；第8天细胞形态成为多角形，细胞基质中出现钙化斑(图4)；14 d后形成钙结节。

    2.2  细胞凋亡率检测

    经流式细胞仪检测后的细胞凋亡率散点图，上象限为坏死细胞；左下象限为正常细胞；右下象限为凋亡细胞。成骨诱导14 d后，幼年组(图5)、成年组(图6)和老年组(图7)细胞凋亡率分别为：（2.32±0.15）%、（2.54±0.16）%、（4.71±0.19）%；未经成骨诱导的对照组(图8)凋亡率为（2.25±0.11）%。诱导后幼年组细胞凋亡率与对照组之间的差异无统计学意义(p>0.05)，但与成年组之间的差异有显著性统计学意义(p<0.05)，与老年组之间的差异有非常显著性统计学意义(p<0.01)。

    2.3  碱性磷酸酶(alp)活性测定

    不同年龄段的adscs经过诱导后alp活性之间存在差异(图9)，除对照组外其他各组细胞均在诱导后第4天alp活性水平显著增高，第12天达到最高峰，此后alp活性水平有所下降。幼年组的alp活性明显大于其它组，与成年组之间的差异有显著性意义(p<0.05)，与老年组之间的差异有非常显著性意义(p<0.01)，各年龄组与对照组之间的差别均有非常显著性意义(p<0.01)。

    2.4  钙离子浓度测定

    成骨诱导7、14、21 d钙含量测定表明，各年龄组细胞外基质中钙含量均随诱导时间的延长而增加，而对照组变化不大(表1)。诱导后第7天幼年组细胞外基质中钙含量与其他各组之间差异无统计学意义(p>0.05)；其他时间点幼年组与成年组之间差异有显著性意义(p<0.05)，幼年组与老年组之间差异有非常显著性意义(p<0.01)。表1  钙离子含量测定注：与幼年组比，*p<0.05，**p<0.01；与老年组比，##p<0.01

    3  讨    论

    我国已进入老龄化社会，年龄因素对成骨能力的影响直接关系到移植后愈合的效果，理想种子细胞的选择应首先考虑年龄的问题。本实验中各年龄段大鼠的脂肪组织均能分离出adscs，细胞呈梭形。幼年组以及成年组细胞提取数量高于老年组。幼年组和成年组细胞胞体较小、集落形成较密集、形态规则、细胞密度大；老年组细胞稍大并且稀疏、散在分布、形成集落小并较少。各年龄段adscs均可稳定传至9代，按支架接种细胞数106～7的要求[8]，经过传代培养后各年龄段的adscs的数量均可满足临床应用需要，但是应充分考虑不同年龄段供体脂肪的抽取量以及种子细胞的扩增时间与病情的需要。

    将第3代adscs成骨诱导后，细胞的形态发生改变由梭形变为多角形，并形成钙结节。凋亡率结果显示，除幼年组与对照组之间的差异无统计学意义外，其他各年龄组细胞凋亡率之间的差异均有统计学意义。显然随年龄的增长，adscs成骨诱导后细胞的凋亡率在不断增大，但各组细胞的凋亡率均不超过5%，说明各年龄段的adscs在成骨诱导后活性依然很强。alp是成骨细胞的一种表面标志性酶和干细胞成骨分化的早期标志。由图9可以看出幼年组、成年组细胞的成骨能力大于老年组，而老年组alp活性大于对照组，说明各年龄段的adscs均有成骨分化的能力，但随着年龄的增加成骨分化能力在不断降低。细胞外基质的矿化是成骨的标志，其最突出的表现为钙离子浓度的大量增加[9]，成骨诱导14 d后各年龄组细胞钙离子浓度呈现出递增趋势，第21天幼年组钙离子浓度处于最高值，成年组次之，老年组最低，显示出了adscs的成骨分化能力随着年龄的增大而呈下降的趋势。

    以上结果证实各年龄段的adscs的成骨分化能力随年龄的增加而降低，在临床应用时应充分考虑年龄因素对adscs成骨分化的影响，本实验为不同年龄段adscs的进一步基础研究和临床应用提供了依据，adscs可能会成为未来骨组织工程中理想种子细胞的来源。（此文图1-9见第95页）

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