作者：李小琴 李坚 陈萍 包泉磊 杜永杰
【摘要】 目的： 探讨肺耐药蛋白(lrp)基因在非小细胞肺癌(nsclc)中的表达及临床意义。方法： 应用rtpcr半定量法检测60例nsclc患者癌组织及癌旁组织中lrp mrna的表达。用t检验、方差分析，kaplanmeier生存曲线和logrank 检验进行统计分析。结果： nsclc患者的癌组织中lrp mrna表达量显著高于癌旁组织(p=0.000),lrp mrna表达量在肺腺癌中高于鳞癌（p=0.02）,中高分化组高于低分化组（p=0.033），但lrp mrna的表达量与其他临床病理相关因素及生存期无相关性。结论： lrp在nsclc的原发性多药耐药（mdr）中可能起重要作用，检测lrp对于预测nsclc患者化疗效果、协助临床选择化疗方案可能具有一定的意义。
【关键词】 非小细胞肺癌； 多药耐药； 肺耐药蛋白; 基因表达
［abstract］ objective: to investigate the expression levels of lrp mrna in patients with nonsmall cell lung cancer(nsclc) as well as their clinical significance.methods： rtpcr semiquantitative method was used to detecte the expression levels of lrp mrna in tissues samples and corresponding adjacent normal lung tissues of 60 patients with nsclc. ttest,oneway anova,kaplanmeier survival curve and logrank test analysis were used for statistical analysis. results： the expression level of lrp mrna was significantly higher in nsclc tissues than that in adjacent normal lung tissues(p=0.000). lrp mrna expression level was significantly higher in lung adenocarcinomas than in squamous carcinoma(p=0.02),and was higher in cancer tissue of welldifferentiated than in that of poorly differentiated(p=0.033).there was no difference in lrp mrna expression level between other clinicopathologic parameters and survival time. conclusion： lrp may play a major role in the intrinsic multidrug resistance of nsclc in some extent. it was significant for detection of the expression level of lrp in nsclc patients that in the prediction of the intrinsic multidrug resistance and in the guidance to rational chemical therapy.
［key words］ nonsmall cell lung cancer; multidrug resistance; lung resistance protein; gene expression
肺癌是临床高发肿瘤之一，早期发现及手术切除是肺癌治疗的关键。WWw.11665.CoM化疗是肺癌治疗的重要手段，但抗癌药物的耐药性是影响治疗疗效的重要因素。目前研究发现,肺耐药蛋白(lung resistance protein, lrp)等参与的药物转运改变(外排增加)所导致的肿瘤细胞内药物浓度下降是多药耐药（multidrug resistance,mdr）发生的主要因素之一，尤其是在对抗癌药不敏感的非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer,nsclc)中更为突出。为此，我们对nsclc中lrp基因的表达进行了研究，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象
选取2003年12月～2006年12月60例在本院行根治性手术nsclc患者的癌组织和癌旁肺组织(距肿瘤边缘5 cm)，按无菌要求将获取半小时内标本放入-70℃低温冰箱中保存。所有病例术前均未接受任何抗肿瘤治疗，术后均经病理学检查证实诊断。60例患者中男性42例,女性18例;年龄34～78岁,中位年龄60岁；肺鳞癌23例，肺腺癌35，腺鳞混合癌2例。依照国际抗癌联盟（uicc）2002年的tnm分期标准,ⅰ期22例，ⅱ期12例，ⅲa期26例。48例有完整随访资料，其中26例仅手术治疗，22例术后接受以铂类为基础的辅助化疗。手术后常规随访至2007年12月30日。
1.2 主要试剂与仪器
trizol试剂为invitrogen公司出品,琼脂糖，dntp为美国promega公司产品，rtpcr 试剂盒，taq dna合成酶为立陶宛mbi公司生产,dna标准参照物由广州东盛生物科技有限公司提供,实验所用引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成。高速冷冻离心机（德国）,紫外分光光度仪（美国beckman公司），pcr 扩增仪、凝胶图像分析系统（美国biorad公司)。
1.3 组织总rna 的提取
按trizol试剂说明书提取肺癌和癌旁组织总rna。提取的rna经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性,通过紫外分光光度计测定260 nm与280 nm光密度值，计算rna的纯度与浓度，用0.1%depc水调节抽提rna至相同浓度,-70℃冻存备用。
1.4 反转录cdna
根据mbi公司rt试剂盒操作说明:取2 μl上述rna液加入oligo(dt18)1 μl，dept水9 μl，在70℃保温10 min。随后加入5×rt 缓冲液4 μl,10 mmol dntp 2 μl,rna 酶抑制剂1 μl,在37℃反应5 min。最后加入mmulv反转录酶1 μl，混匀，在42℃反应60 min,70℃反应10 min后，将cdna保存于-20℃冰箱备用。
1.5 rtpcr反应
反应体系为15 μl:其中10×缓冲液1.5 μl,25 mmol/l mgcl2 1.2 μl,10 mmol/l dntp 0.3 μl,50 pmol/μl上、下游引物各0.12 μl,cdna模板0.6 μl,taq聚合酶0.6 μl,再用ddh2o补足至15 μl。引物序列如下：gapdh上游引物5′atgaccacagtccatgccat3′,下游引物5′ttcctcttgtgctcttgctg3′，扩增长度526 bp。lrp上游引物5′gcattattcgcactgctgtc3′，下游引物5′agcctccagctccaagagtt3′，扩增长度343 bp。pcr循环参数为:95℃预变性5 min, 95 ℃变性30 s,62 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min，共扩增35个循环，最后72 ℃10 min延伸结束反应。
1.6 凝胶电泳半定量及结果判断标准
取rtpcr产物10 μl,在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，溴化乙啶显色，置自动凝胶成像分析系统中照相,并记录各扩增条带的积分光密度(integral optical density，iod)。分别取目的基因lrp mrna与内参基因gapdh mrna rtpcr产物电泳条带iod比值,作为目的基因mrna的相对含量。以lrp mrna的中位数为界,分为高表达组和低表达组后再进行分析。
1.7 统计学处理
两均数间比较用t检验，多均数间比较采用单因素方差分析(方差齐性),总体生存分析的比较采用kaplanmeier生存曲线和logrank检验。以上均采用spss 13.0统计软件进行分析处理。显著性水平为p<0.05，均为双侧检验。
2 结果
2.1 lrp mrna在nsclc及癌旁组织中的表达
应用rtpcr在nsclc中可检测到lrp mrna的表达，在60例nsclc患者的癌组织中lrp mrna的表达量为0.461 5±0.050，显著高于癌旁组织的表达量0.241 6±0.029,差异有统计学意义(p=0.000)(图1)。
m：dl2000 标准参照物； 1，5：癌组织gapdh mrna；3，7：癌旁组织gapdh mrna；2，6：癌组织lrp mrna；4，8：癌旁组织lrp mrna
图1 lrp mrna在nsclc癌组织和癌旁组织中的表达（略）
fig 1 expressions of lrp mrna in tumor tissue of nsclc and adjacent normal lung tissue
2.2 lrp mrna在nsclc中的表达与临床病理特征及生存期的关系
60例nsclc的lrp mrna表达与患者性别、年龄、吸烟史、肿瘤大小、淋巴结转移、tnm分期均无明显关系,p值均大于0.05(见表1)；lrp mrna在肺腺癌中的表达量高于鳞癌(p=0.02),中高分化组高于低分化组(p=0.033)。根据48例患者肺癌组织中lrp mrna表达量(相对于gapdh)将其分低和高表达组(以中位数=0.431 3为界,≤0.431 3为低表达组,>0.431 3为高表达组，各24例),两组患者的中位生存期（48月，25月）,lrp mrna低表达组的生存期虽然较高表达组为长,但差异无统计学意义(p=0.307,图2)。
表1 非小细胞肺癌中lrp mrna表达与临床病理的关系(t检验或方差分析)（略）
tab 1 correlation of lrp mrna expression levels with clinicopathologic in nsclc
图2 lrp mrna表达对nsclc患者生存影响曲线图(kaplanmeier)
fig 2 survival curves for the nsclc patients influenced by expression of lrp mrna
3 讨论
nsclc占所有肺癌的80%，是最常见的肺部恶性肿瘤，由于大部分病例发现时已处于中晚期，除部分患者可手术治疗外，化疗仍是临床上综合治疗的主要手段。但迄今为止临床化疗的效果仍不能令人满意，其中最根本的问题是肿瘤细胞耐药引起的临床化疗失败。目前研究发现,药物转运的改变(外排增加)所导致的肿瘤细胞内药物浓度下降是多药耐药发生的关键因素之一。已发现与药物转运有关的膜糖蛋白主要有mrp1，lrp和pgp等多种膜转运蛋白。lrp基因全长2 688 bp,位于16号染色体q13.111.2带上,编码的lrp蛋白由896个氨基酸组成。 lrp是穹隆蛋白的主要成分，与细胞核、细胞质运输有关,一方面可降低药物的核质分布比例以降低药物的有效浓度,另一方面可通过囊泡转运和胞吐机制将胞质内药物排出细胞外,降低细胞内药物的绝对浓度。lrp在nsclc中广泛表达,与肿瘤细胞耐药有关，在临床上常为肺癌患者独立的预后不良因素。我们的研究显示lrp mrna在未经化疗的nsclc和癌旁组织中均有较高的表达，但在癌组织中的表达量明显高于癌旁组织，这与大多数研究结果相符［1,2］，说明lrp在nsclc的原发性多药耐药（mdr）中可能起重要的作用。
berger等［3］的实验表明lrp蛋白表达阳性的肺癌细胞耐药谱广，lrp不仅能介导与mdr相关的药物耐药,而且对ddp有较强的耐药性。harada等［4］应用免疫组化检测nsclc患者经支气管肺活检的癌组织内lrp蛋白表达，结果lrp阳性表达的鳞癌患者对铂类为主的化疗有效率只有33%,而lrp阴性者为100%,两者差异有统计学意义,提示lrp可作为评价肺鳞癌患者对ddp化疗敏感性的一项指标。
关于lrp表达与nsclc的组织学类型的关系,较多文献报道腺癌中lrp的表达量高于鳞癌［1,5,6］。多数研究发现在nsclc中，lrp表达与性别、年龄、分期、肿瘤分化程度以及淋巴结转移情况无明显相关性［5,6］。有研究认为肺癌中lrp表达与吸烟与否有关［6］。本研究结果显示lrp mrna表达量与患者性别、年龄、吸烟史、肿瘤大小、淋巴结转移、tnm分期均无明显关系（p≥0.05）；在腺癌中的表达量明显高于鳞癌（与多数文献报道相同)；中高分化组明显高于低分化组，这与临床上nsclc腺癌化疗较鳞癌相对不敏感,中高分化癌较低分化癌相对不敏感吻合,进一步说明lrp是导致nsclc患者多药耐药的主要原因之一，检测lrp对于预测nsclc患者化疗效果、协助临床选择化疗方案可能具有一定的意义。
关于lrp表达程度对nsclc预后的影响有不同的报道，有研究认为lrp表达与nsclc的预后相关，可作为一个独立的预后因子［7］；而volm等［6］和dingemans等［8］的研究显示lrp表达与nsclc的预后无关。本研究显示lrp mrna低表达组的中位生存期长于高表达组,但差异无统计学意义。以上差异可能与病例选择不同、检测方法相异等有关。lrp与nsclc预后的关系有待进一步研究。
【参考文献】
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