【摘要】 目的： 探讨脉络丛组织、neuro2a细胞株对胚胎脊髓运动神经元轴突生长的影响。方法： 采用ecm gel作为组织培养的基质底物，将脉络丛组织或者neuro2a细胞株和胚胎12天的腹侧脊髓运动神经柱进行三维共培养，观察脉络丛组织或者neuro2a细胞株对胚胎脊髓运动神经元轴突生长的影响。结果： 脉络丛组织或者neuro2a细胞株与胚胎12天的腹侧脊髓组织共培养2天后，脊髓运动神经元轴突表现为偏离脉络丛组织或者neuro2a细胞株的偏向性生长。 结论： 脉络丛组织和neuro2a细胞株对胚胎脊髓运动神经元轴突有排斥作用。
【关键词】 slit2 脉络丛 脊髓运动神经元轴突 维共培养
［abstract］ objective: to investigate the effect of the choroid plexus or the neuro2a cells on the embryonic spinal motor axons.methods： to use ecm gel as a tissue culture substrate, 3dimention coculture of the choroids plexus or the neuro2a cells with the ventral part of the embryonic spinal motor column (embryonic 12 days, e12)were made in the substrate.to observe the effect of the choroid plexus or the neuro2a cells on the embryonic spinal motor axons. results： after 2 days of coculture,we found more spinal motor axons were grown from the distal part of the choroid plexus or the neuro2a cells. conclusion： the choroid plexus and the neuro2a cells had the repelling effect on embryonic spinal motor axons.
［key words］ slit2;choroid plexus; the embryonic spinal motor axons; 3dimention coculture
神经细胞迁移和轴突导向是神经系统发育和再生过程中的重要问题。WwW.11665.CoM目前发现一系列与神经迁移和神经元轴突导向有关的分子,如slit, netrin, semaphorin, ephrin等［1］。 slit和其受体robo(roundabout)是目前研究较热的一对轴突导向分子，其研究主要集中在神经系统发育方面，特别是对于调控联合神经元轴突穿越中线的作用研究已成为热点［2］；而对于中枢神经损伤后再生作用机制的研究较少［3］。我们建立脉络丛组织、neuro2a细胞株与胚胎脊髓运动神经柱的三维共培养体系，观察两者对运动神经元轴突生长影响的作用,从脊髓发育角度探索脊髓损伤后的脊髓神经轴突再生、导向的机制。
1 材料和方法
1.1 材 料
1.1.1 实验动物 胚龄分别为12天、19天的sd孕鼠。sd大鼠购于江苏大学实验动物中心。将成熟的雌雄成年sd大鼠合笼后，次日清晨查雌性大鼠，作阴道涂片，见到精子者定为受孕第0天，计为p0。
1.1.2 主要试剂 l15培养基（gibco公司），dmem/f12 （gibco公司），fbs（gibco公司），pbs（boster公司），ecm gel(sigma公司)，青霉素、链霉素（华北制药股份有限公司）等。
1.1.3 主要实验器材 eppendorf台式离心机，超净工作台（airtech公司），co2 恒温细胞培养箱（thermo公司），24孔细胞培养板（corning公司）, 显微手术器械一套，体视显微镜（olympus公司）,倒置相差显微镜（olympus公司），滤器（millipore公司:孔径0.22 μm），玻璃圆盖片（直径：14 mm），一次移液管（coster公司），一次性注射器（规格1 ml,5 ml）等。
1.2 方 法
1.2.1 胚胎sd大鼠的取材 （1）按要求分别取胚胎12天、19天的sd孕鼠,断颈处死,放置于75%乙醇中浸泡消毒10 min。在超净台中取出乙醇浸泡后的孕鼠,将其仰卧位固定在大鼠解剖台上。无菌操作下取下腹部弧形切口,依次切开皮肤、皮下组织、腹部肌肉，显露双角子宫，在不侵入子宫和刺破羊膜的情况下取出呈现“串珠样”含有胚胎的子宫。（2）将取出的含有胚胎的子宫放置在无菌培养皿中。眼科剪剪开子宫，羊膜，取出鼠胚，放置于盛有双抗的pbs培养皿中，洗去残余血迹待用。
1.2.2 含有胚胎背部肌肉提取物培养基的配制 （1） 将取出的胚龄为19天的胎鼠放在一干燥培养皿中，将鼠胚用眼科剪断头，取其背部肌肉称重为0.5 g（湿重），剪碎后放入30 ml dmem/f12培养基中浸泡，半小时后取浸泡液行4 000 r/min离心15 min，取上清液行抽滤处理（需2～3个滤器）。（2） 用无菌的dmem/f12将滤液稀释至100 ml，加入双抗后备用。
1.2.3 脉络丛组织的分离和培养 (1) 取成年大鼠（3月龄，雌雄不限），断头处死，鼠头放置于75%乙醇中浸泡消毒10 min。在超净台中取出乙醇浸泡的鼠头，固定在解剖台上。(2)无菌操作下依次纵行剪开头部正中的皮肤，显露颅骨，血管钳咬除颅骨后显露大脑。(3)眼科镊取出大脑，放置于含有双抗的无菌pbs中，洗去残余血液，眼科剪沿大脑冠状面切开大脑，显露两侧侧脑室，在侧脑室后方用眼科镊取脉络丛组织。(4)取出的脉络丛组织放置在含双抗dmem/f12的培养基中，放置于co2 恒温细胞培养箱中待用。
1.2.4 大鼠脊髓前角运动神经柱的分离 （1）将取出的胚龄为12天的胎鼠放入盛有少量l15培养基的无菌培养皿中，在体视显微镜下用1 ml一次性注射器2支作为解剖针顺行取出脑干平面以下脊髓组织, 剔除脊髓被膜，取出的脊髓放入4℃含有双抗的l15培养基中。（2）在体视显微镜下将取出的脊髓组织继续用1 ml一次性注射器2支作为解剖针将脊髓的腹侧前柱取出（open book method）［4］,放在4℃含双抗的l15培养基中待用。
1.2.5 脊髓运动神经柱与脉络丛组织的共培养 ①在体视显微镜下将前取出的脉络丛和脊髓前角运动神经柱用显微器械分离成小段（1 mm × 1 mm大小）; ②将分离的脉络丛组织小段和脊髓前柱小段放在无菌的圆盖片中,调节彼此距离使其靠近但又不接触(小于1 mm距离);③用4℃无菌的ecm gel（每孔20 μl）作为三维培养基质胶覆盖固定两组织块;④将圆盖片放入24孔板中，加入37℃的含有胚胎背部肌肉提取物dmem/f12的双抗培养基。co2恒温培养箱培养24～36 h后观察共培养结果。
1.2.6 脊髓运动神经柱与neuro2a细胞株的共培养 ①将neuro2a细胞株分别用0.25%胰蛋白酶消化，10%胎牛血清dmem/f12中和，离心后弃去上清得到细胞。将细胞用4℃ ecm gel溶解后，将含有细胞的ecm gel以每孔5 μl种植于玻璃圆盖片的中央;②待ecm gel凝固后，将分离脊髓前柱小段放在预先凝固了的基质胶上，并调节彼此距离使其靠近但又不接触(小于1 mm距离);③用4℃无菌的ecm gel（每孔20 μl）作为三维培养基质胶覆盖固定脊髓组织和细胞悬滴;④将圆盖片放入24孔板中，加入37℃的含有胚胎背部肌肉提取物dmem/f12的双抗培养基。co2恒温培养箱培养24～36 h后观察共培养结果。
2 结 果
2.1 脊髓前角运动神经元、脉络丛组织共培养36 h后脊髓运动神经元轴突生长情况
在脊髓前角运动神经元、脉络丛组织共培养36 h后，脊髓腹侧组织背离脉络丛一侧的神经轴突生长旺盛且较长，轴突生长方向无明显偏向，呈现放射状生长（图1a）；脊髓腹部组织靠近脉络丛一侧的轴突偏向,背离脉络丛生长,且轴突生长较少较短（图1b）。
2.2 脊髓前角运动神经元、neuro2a细胞株共培养脊髓运动神经元轴突生长随时间变化的情况
在脊髓前角运动神经元、neuro2a细胞株共培养24 h后脊髓运动神经元轴突呈现极向生长；36 h后极向生长更加明显，表现为面向细胞聚集团的脊髓运动神经元神经轴突数量较少，长度较短；而远离细胞聚集团的脊髓运动神经元神经轴突数量密集，生长旺盛，呈现放射性生长。见图2。图2左侧为neuro2a细胞株；右侧为脊髓前角运动神经柱组织。
3 讨 论
slit最初是在果蝇体内发现的细胞外信号分子，是在进化中高度保守的蛋白,后来发现哺乳动物体内主要由发育期的脊髓中线胶质细胞和大脑中隔组织分泌。brose等［5］指出slit分子是发现的第一种对神经元迁移和轴突生长都有导向作用的因子。 wu等［6］指出slit这种轴突导向和神经细胞迁移在分子机制上是有共同性的。wang等［7］体外研究结果表明大脑中隔可分泌排斥性分子,引导脑室下区(svz)神经元迁移，这种引导机制依赖于slit的浓度梯度，而不是其绝对量，从而进一步证实了slit蛋白在引导神经系统的细胞上起着可扩散分子的角色。体外实验证明, slit蛋白具有双重功能：slit2全片段能排斥运动神经元轴突、嗅觉中间神经元、齿状突神经元，而n末端的slit2则可以促进感觉神经纤维的分支和延伸。迄今为止，在哺乳类动物中已发现slit1，slit2，slit3三个成员，nquyen bacharvet等［8］则进一步指出slit2在控制轴突生长方向的过程中起着主要作用。lin等［9］研究认为slit2在中脑腹侧多巴胺神经元的轴突导向中起着排斥作用，并且提出这种调节可能在对于多巴胺神经元的轴突维持、再生和靶目标识别中起重要作用。
seita等［10］用原位杂交研究slit mrna在冷凝损伤脑中的表达，其中slit2 mrna在坏死区周围的胶质细胞表达最强烈，双标研究显示， slit2 mrna在胶质纤维酸性蛋白(gfap)阳性星形胶质细胞表达，glypican1作为slit2的高亲和受体在反应性胶质细胞内与slit2共表达，因而认为它能促进slit2和robo1的结合，并认为slit2可能防止再生的轴突进入病灶，成为中枢神经系统再生障碍的另一原因。肖卫东等［11］通过rtpcr等研究发现，大鼠在sci后slit2表达上调，7天达到高峰,之后下降，并且提出sci后一过性slit2表达上调可能是胶质细胞增生反应中细胞因子调控失衡的表现，并可能成为轴突再生的抑制因素。
hu［12］发现大脑脉络丛可以排斥大脑皮质神经元和嗅觉中间神经元前体，这种排斥作用和中隔性质的排斥作用类似，从而提出大脑皮质神经元不向脑室迁移以及嗅觉神经元不向尾侧而是沿着嘴状迁移流（rostral migration stream,rms）方向迁移的可能机制，即脉络丛分泌的排斥性物质参与大脑皮质神经元导向作用，同时在研究过程中发现一种小鼠神经母细胞瘤 (neuro2a细胞株)分泌一种相对分子质量和全长slit2一致（190 kda）的蛋白，并且发现这种分泌蛋白和slit2抗体存在交叉反应，从而提出这种分泌蛋白可能是slit2或者是slit 家族的其他成员。既然slit2全长片段可以排斥脊髓运动神经元轴突［7］，而脉络丛组织和neuro2a细胞株可能分泌全长slit2，因此我们将脉络丛或neuro2a细胞株与胚胎脊髓运动神经元共培养，来研究slit2对于脊髓运动神经元轴突生长的作用。在研究中，我们选取胚龄为12天的sd大鼠胚胎脊髓，此时脊髓运动神经元处于分化阶段，有利于我们观察轴突生长变化；我们选取胚龄19天的sd大鼠背部肌肉提取物作为培养基，考虑到含有背部肌肉提取物的培养基中可能含有促进神经生长的物质。通过实验我们发现脉络丛或 neuro2a细胞株确实排斥胚胎脊髓运动神经元轴突，从而在体外证实了脉络丛或 neuro2a细胞株对胚胎脊髓运动神经元轴突生长存在排斥性导向作用，与体内一致。这种排斥性导向作用很有可能为slit2所参与。
【参考文献】
［1］ seeger ma, beattie ce. attraction versus repulsion: modular receptors make the difference in axon guidance［j］. cell, 1999, 97(7): 821-824.
［2］ linda jr. surrounded by slithow forebrain commissural axons can be led astray［j］. neuron, 2002, 33(2): 153-155.
［3］ 肖卫东，易成腊. 成年大鼠sci后神经生长导向因子netrin和slit的表达及定位［j］.中国脊柱脊髓杂志，2006，16，（11）：843-846.
［4］ guthrie s, pini a. chemorepulsion of developing motor axons by the floor plate［j］. neuron, 1995, 14(6): 1117-1130.
［5］ brose k, bland ks, wang kh, et al. slit proteins bind receptors and have an evolutionarily conserv5d role in repulsive axon guidance［j］. cell, 1999, 96(6): 795-806.
［6］ wu w, wong k, chen j,et al. directional guidance of neuronal migration in theolfactory system by the protein slit［j］. nature, 1999, 400 (6742): 331-336.
［7］ wang kh, brose k, amott d, et all. biochemical purification of a mammalian slit protein asa positive regulator of sensory axon elongation and branching［j］. cell, 1999, 96 (6): 771-784.
［8］ nquyen bacharvet kt, brose k, ma l, et al. diversity and specificity of actions of slit2 proteolytic fragments in axon guidance［j］. j neurosci, 2001, 21(12): 4281-4289.
［9］ lin l, rao y, isacson o. netrin1 and slit2 regulate and direct neurite growth of ventral midbrain dopaminergic neurons［j］.mol cell neurosci,2005, 28(3): 547-555.
［10］ seita h, ken i, tetsiji m, et al. slit and glypican1 mrnas are coexpressed in the reactive astrocytes of the injured adult brain［j］.glia, 2003, 42(2): 130-138.
［11］ 肖卫东，易成腊.神经生长导向因子slit2在成年大鼠急性脊髓损伤后的表达［j］.中华实验外科杂志, 2006,23 (8): 987-989.
［12］ hu h. chemorepulsion of neuronal migration by slit2 in the developing mammalian forebrain［j］. neuron, 1999, 23（4）: 703-711.
