摘要】 目的 观察奥曲肽或联合经瞳孔温热疗法(ttt)对大鼠脉络膜新生血管(cnv)的疗效。方法 使用激光诱导大鼠cnv，光凝术后7d球后注射磷酸缓冲盐溶液(pbs组，n=6）、奥曲肽50μg/kg（n=6）以及奥曲肽50μg/kg联合ttt（n=6），另取3只大鼠未给与激光及球后注射，用于实时定量pcr（qrtpcr）检测。光凝术后14d采用眼底荧光血管造影观察cnv的荧光渗漏变化，脉络膜铺片定量分析cnv面积变化，qrtpcr观察rpe脉络膜复合物血管内皮生长因子(vegf)和胰岛素样生长因子1(igf1) mrna表达水平的变化。结果 奥曲肽或奥曲肽联合ttt能有效抑制cnv荧光渗漏，使cnv面积减小，vegf和igf1 mrna水平较pbs组明显降低(p<0.05)，联合疗法的抑制作用更为显著(p<0.05)。结论 奥曲肽联合ttt为治疗cnv提供了一条新的途径。
【关键词】 脉络膜新生血管化 奥曲肽 经瞳孔温热疗法 治疗结果 大鼠
qu yi, zhang ying, zhang xiao, zhou fang, xu xiaoyi
(department of ophthalmology, qilu hospital of shandong university, jinan 250012, china)
to explore the possibility of only octreotide or octreotide combined with transpupillary thermotherapy (ttt) to inhibit choroidal neovascularization (cnv) in rat models. methods cnv was induced in adult rats with laser photoagulation. on postoperative day 7 pbs was retrobulbarly administered to 6 rats, octreotide 50μg/kg only to 6 rats, and octreotide 50μg/kg combined with ttt to 6 rats. an additional 3 rats were not treated with laser or retrobulbar injection. on day 14 after photoagulation, fluorescein angiography was used to observe the fluorescein leakage, quantitative analysis on choroidal flatmounts was performed to evaluate the changes of cnv lesions, and quantitative real time reverse transcription polymerase chain reaction (qrtpcr) examinations were used to observe the changes of vascular endothelial growth factor (vegf) and insulinlike growth factor 1(igf1) mrna in rpechoroidal complex. results the results demonstrated octreotide only or the combined therapy significantly inhibited fluorescein leakage on fa and the extent of neovascularization on choroidal flatmount of rat cnv models, and the vegf and igf1 mrna levels were obviously decreased following both treatments (p<0.05). combined administration was more efficient (p<0.05). conclusion octreotide combined with ttt may provide a potential new therapeutic strategy for cnv.
key words： choroidal neovascularization； octreotide； transpupillary thermotherapy； treatment outcome； rats
年龄相关性黄斑变性(amd)是造成65岁以上人群视力丧失的首位病因［1］。WWW.11665.coM晚期amd可分为干性amd和湿性amd，湿性amd临床表现为脉络膜新生血管(choroidal neovascularization, cnv)形成，是造成80%amd患者失明的原因。cnv的形成有多种生长因子参与， 包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, vegf)和胰岛素样生长因子1(insulinlike growth factor 1, igf1)［23］。奥曲肽是生长抑素类似物，能有效治疗早产儿视网膜病变和增殖性糖尿病视网膜病变［45］，经瞳孔温热疗法(transpupillary thermotherapy, ttt)对继发于amd的cnv具有治疗作用［6］。本研究拟通过观察奥曲肽以及联合ttt对大鼠cnv模型的治疗效果，探索治疗cnv的新途径。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器 奥曲肽（瑞士诺华制药公司），异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(fitcdextran；分子量2×106；美国sigmaaldrich公司)，trizol (美国invitrogen公司)，superscript ⅱ逆转录酶(美国invitrogen公司)，faststart master sybr green ⅰ试剂(美国roche分子生物化学公司)。532nm半导体激光（viridislite; 法国bvi公司），810nm半导体激光(美国iridex公司），眼底荧光血管造影机（hra, 德国heidelberg engineering公司），leica dmr荧光显微镜（德国leica公司），abi prism 7500pcr仪(美国applied biosystems公司)。
1.2 方法
1.2.1 cnv大鼠模型的建立 选取18只棕色挪威大鼠（体质量280～350g，购自北京威通利华公司），氯胺酮(40mg/kg) 和甲苯噻嗪(8mg/kg)混合液皮下注射麻醉，0.5%美多丽散瞳，0.4%倍诺喜表面麻醉。使用532nm半导体激光通过接触式前置镜和裂隙灯，距离视盘2～3视盘直径击射8点，光凝参数为75μm, 0.1s, 130mw，击射点出现气泡表明bruch膜破裂。
1.2.2 实验动物分组和处理 18只大鼠分为3组，每组6只，光凝术后7d，分别球后注射磷酸缓冲盐溶液(pbs组)0.15ml；奥曲肽50μg/kg(奥曲肽组)或奥曲肽50μg/kg联合ttt(奥曲肽联合ttt组)。ttt采用810nm半导体激光，参数：光斑直径约2mm，以完全覆盖cnv损伤为准；曝光时间1min；能量50～70mw，先在周边正常视网膜测试，光凝处出现轻微可见改变，降低10mw后照射cnv病变。另取3只大鼠作为非激光照射及眼内注射组。
分别于光凝术后和球后注射后第1天以及每隔3d行裂隙灯检查，观察是否并发眼内炎和玻璃体出血。光凝术后14d做眼底荧光血管造影(fluorescein angiography, fa)，每组取3只用于脉络膜铺片，另外3只与非激光照射组一起进行实时定量rtpcr (quantitative real time reverse transcription polymerase chain reaction, qrtpcr)检测。
1.3 实验检测
1.3.1 fa检查 成功麻醉后，大鼠皮下注射10%荧光素钠0.15ml，选取180～200s时的fa照片，记录荧光渗漏的程度。0：无渗漏；1：轻度渗漏；2：中度渗漏；3：重度渗漏。
1.3.2 使用铺片技术对cnv损伤进行定量分析 成功麻醉后，由大鼠左心室灌入5ml 50mg/ml的fitcdextran，眼球摘除后用4%多聚甲醛固定1h，去除眼前节和视网膜，制作视网膜色素上皮(rpe)脉络膜铺片，使用leica dmr荧光显微镜和nih图像分析软件测量分析cnv损伤的面积。
1.3.3 qrtpcr检测vegf和igf1的表达 光凝术后14d，取实验组每组3只大鼠和非激光照射组3只大鼠一并由过量氯胺酮处死，摘除眼球，获取rpe脉络膜复合物。按照试剂说明书使用trizol抽提组织总rna，紫外线分光仪测定rna的浓度和纯度，凝胶电泳图上条带28s∶18s为2∶1。使用superscript ⅱ逆转录酶取1μg总rna加入oligo dt，合成cdna。pcr反应体系：faststart master sybr green ⅰ试剂，2μl cdna，10pmol vegf或igf1或8.5pmol 36b4和pcr引物。引物序列: vegf 3′ utr 5′; 5′cag aaa cac gac aaa ccc atc c3′, vegf 3′ utr 3′; 5′taa gcc act cac aca cac agc c3′, igf1 5′; 5′ctc tgc ttg ctc acc ttt ac3′, igf1 3′; 5′ttt cct gca ctt cct cta ctt3′ and 36b4 5′; 5′ccg tgt gag gtc aca gta cc3′, 36b4 3′; 5′gta gtc agt ctc cac aga caa agc3′。36b4作为内参照。pcr反应由abi prism 7500pcr仪和测序软件v1.2.3完成。非激光照射组的mrna浓度作为参照值，设定为1，实验组分别与之比较，报告为倍数关系。每次实验每份样品为双份加样，实验重复3次，结果近似。
1.4 统计学处理 fa图像的渗漏评分比较采用mannwhitney检验；cnv面积比较采用t检验；数据表示为
2 结 果
2.1 注射奥曲肽对动物的影响 实验进行期间，所有动物食欲正常，活动自如。球后给予奥曲肽未发现体重减轻、严重感染或药物致死等明显副作用。观察期间未发现眼内炎和玻璃体出血。
2.2 fa图像分析结果 光凝术14d后，fa显示，与pbs组(图1a)相比，球后注射奥曲肽50μg/kg(图1b)或奥曲肽50μg/kg联合ttt(图1c)的荧光渗漏比明显减少(p<0.05),单纯球后注射奥曲肽和奥曲肽联合ttt均能有效抑制cnv造成的荧光渗漏(表1)，联合治疗的作用更显著(p<0.05)。2.3 cnv损伤的定量分析结果 与pbs组（图2a）相比，奥曲肽组cnv面积缩小21.4%（图2b），奥曲肽联合ttt组缩小53.4%（图2c），差异均具有统计学意义(p均<0.05),见表1。说明两种治疗方式均有效，联合治疗的抑制作用更为显著。表1 奥曲肽和奥曲肽联合ttt对cnv的治疗效果比较
cnv面积(μm2)sd(μm2)pbs组222001611奥曲肽组17443*1275奥曲肽联合ttt组10353*13512.4 vegf和igf1 mrna的表达结果 与非激光光凝组相比，光凝术后14d，pbs组脉络膜复合物的vegf和igf1 mrna水平明显升高(p<0.05)；与pbs组相比，奥曲肽组或奥曲肽联合ttt组vegf和igf1 mrna水平均显著下降(p<0.05)，说明奥曲肽或奥曲肽联合ttt均能抑制大鼠cnv模型的rpe脉络膜复合物的vegf和igf1 mrna水平，联合治疗的作用更显著(p<0.05)，见图3。光凝术后14d，球后注射奥曲肽50μg/kg或联合ttt术后7d，脉络膜复合物的vegf mrna(a)和igf1 mrna(b)的相对表达水平
3 讨 论
amd是光感受器rpebruch膜-脉络膜毛细血管病变，能够导致中心视力丧失, 随着人口老龄化，发病率呈上升趋势［7］。湿性amd的临床治疗包括激光、ttt、光动力疗法、手术、放射治疗和药物治疗等。药物治疗主要针对vegf，采用其抗体或适体等抑制cnv［8］，但其作用有限，亟需探索新的治疗手段。
人类眼局部多种细胞如rpe细胞、内皮细胞、视网膜毛细血管周细胞、muller细胞和神经节细胞在缺氧或炎症刺激下分泌igf1等有丝分裂因子，igf1采用自分泌调节方式选择性刺激rpe细胞分泌vegf［9］，通过第二信使ca2+上调vegf转录，诱导cnv的发生。本研究qrtpcr结果显示，光凝术后14天，rpe脉络膜复合物的vegf和igf1 mrna水平明显升高，证实vegf和igf1参与了cnv的发生。
生长抑素类似物在糖尿病视网膜病变表现出抗新生血管的特性，但在cnv形成过程中的作用尚未见报道。本研究结果显示，奥曲肽能够使vegf和igf1 mrna表达水平明显下降，cnv造成的荧光渗漏减少，脉络膜铺片的cnv损伤的面积缩小，证实奥曲肽对cnv大鼠具有抗新生血管活性作用，推测奥曲肽是通过vegfigf1途径抑制cnv。igf1能够直接作用于内皮细胞促进细胞的迁移和增殖，奥曲肽也可能通过抑制这条非vegf通路抑制血管新生。但奥曲肽是否具有直接阻断其他新生血管因子前体的产生或刺激其他抗新生血管因子的功能，尚有待证实。
本研究结果表明，单独使用奥曲肽的作用有限，cnv面积仅较对照组减少21.4%，奥曲肽联合ttt的作用明显增强，cnv的荧光渗漏显著减少，cnv面积较pbs组减小53.4%，较单独使用奥曲肽减小31.9% ，vegf和igf1 mrna水平显著下降。ttt是一种非侵入性治疗方法，采用阈值下能级、大光斑、长曝光时间的半导体激光通过瞳孔将长脉冲激光的热能输送到黄斑区附近，直接照射异常血管使其闭锁。ttt通过热传导和对流使视网膜和脉络膜的温度迅速平衡，在激光斑内，rpe和紧邻的脉络膜毛细血管及光感受器由ttt造成温度升高，使异常血管闭锁［10］。推测ttt除直接治疗cnv外，可能同时促进奥曲肽在病变局部的吸收，从而增强抑制作用。使用奥曲肽可能会降低激光治疗所需参数，减少ttt引起的照射局部的细胞凋亡及视网膜损伤。
本研究结果显示，球后注射奥曲肽联合ttt治疗能够有效抑制大鼠cnv，而且在观察期内未发现严重的毒副作用，表明联合治疗对眼局部和全身均安全有效。提示球后注射奥曲肽联合ttt为靶向性治疗继发于amd的cnv提供了新的途径。
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