【摘要】 目的: 构建pcdna3.1mox40ig真核表达载体, 转染cho细胞进行稳定表达, 获得有生物学活性的mox40ig融合蛋白。方法: rtpcr法扩增获得higg1fc段基因, 构建pcdna3.1higg1fc重组质粒并经测序证实。从本室保存的pires2egfpmox40重组质粒中pcr扩增mox40胞外段, 将其插入pcdna3.1higg1fc重组质粒中构建pcdna3.1mox40ig真核表达载体。脂质体法转染cho细胞获得稳定表达, 用rtpcr与elisa法检测其表达, 蛋白a亲和纯化后, sdspage进行鉴定。3htdr掺入法研究ox40信号对b细胞的体外促增殖作用。结果: 测序证实higg1fc段、 mox40胞外段及mox40ig基因序列正确, rtpcr与elisa证实mox40ig的表达, sdspage证实其为mox40ig融合蛋白, 3htdr掺入法显示mox40ig在体外能有效地促进b细胞增殖。结论: 成功地构建pcdna3.1mox40ig真核表达载体, 并获得有生物学活性的mox40ig融合蛋白的稳定表达, 为进一步开展ox40相关领域的横向应用研究奠定了基础。
【关键词】 ox40 mox40 ig cho细胞 真核表达
[abstract] aim: to construct a recombinant eukaryotic expression vector containing pcdna3.1mox40ig fusion gene and obtain mox40ig fusion protein with bioactivity by transfecting cho cells. methods: the gene fragment encoding the human igg1fc was amplified by rtpcr and the eukaryotic expression vector pcdna3.1higg1fc was constructed. after sequencing, mox40 extracellular gene was cloned from pires2egfpox40 by pcr and then inserted into the recombinant vector pcdna3.1higg1fc. the right recombinant was transfected into cho cells with lipofectin ragent and its expression was detected by rtpcr and sandwichelisa. after purified by protein a affinity column chromatography, the mox40ig fusion protein was identified by sdspage and its effect on the proliferation of b cells in vitro was studied by 3htdr method. results: the higg1fc, mox40 extracellular gene and mox40ig gene were consistent with dna sequencing.the expression of mox40ig fusion protein in cho cells was confirmed by rtpcr, sandwichelisa and sdspage. 3htdr analysis showed the mox40ig fusion protein stimulated the proliferation of b cells in vitro. conclusion: a eukaryotic expression vector containing pcdna3.1mox40ig has been constructed successfully and the stable expression of mox40ig fusion protein with bioactivity has been acquired, which lays a solid basis for further study of the application related to ox40.
[keywords]ox40; mox40ig; cho cell line; eukaryotic expression
ox40/ox40l作为免疫应答过程中一对重要的协同刺激分子, 对延长t细胞的寿命、 促进其增殖[1, 2]、 刺激dc细胞的分化成熟[3]、 促进生发中心的形成均有重要的作用[4]。www.11665.Com本研究我们通过构建pcdna3.1mox40ig真核表达载体, 将其转染cho细胞, 获得可溶性mox40ig融合蛋白的稳定表达, 并进行初步的鉴定和生物学活性检测, 为进一步研究ox40分子在肿瘤免疫、 自身免疫性疾病中的作用奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料 trizol购自gibco公司; mmlv第1链cdna合成试剂盒、 taq dna聚合酶、 各种限制性内切酶及t4连接酶均购自mbi公司; agarose（西班牙分装）购自上海生工公司; lipofectin reagent购自invitrogen公司。胎牛血清购自杭州四季青公司。g418购自北京华美公司。蛋白a亲和层析柱购自本元正阳公司。羊抗人igg、 正常人igg、 hrp标记鼠抗人iggfc购自宁波新芝生物公司。小鼠migm激发型抗体及抗cd40激发型单克隆抗体(mab)购自r&d公司。 3htdr购于中国原子能科学研究院。
1.2 方法
1.2.1 引物的设计与合成 根据genbank中登录的人igg1fc段及小鼠ox40胞外段 cdna序列, 利用引物设计软件primer premier5.0进行引物设计, 全部引物由上海生工合成。higg1fc段上、 下游引物p1、 p2为: 5′cggaattcacttgcccaccgtgcccag3′, 含ecor i的酶切位点, 5′ccgctcgagtcatttacccggagacagggag3′, 含xho i的酶切位点。小鼠ox40胞外段上、 下游引物p3、 p4为: 5′cgggatccaagatgtatgtgtgggttcag3′, 含bamh i的酶切位点, 5′cggaattcaggtccctcaggagtcac3′, 含ecor i的酶切位点。
1.2.2 rtpcr法扩增higg1fc段基因 ficoll密度梯度离心法分离正常人外周血单个核细胞后, 按trizol试剂盒说明书抽提总rna。rtpcr反应体系为20 μl: 在冰浴的eppendorf管中依次加入总rna 5 μl, 随机引物1 μl和无rna酶去离子水6 μl, 轻轻混匀后70℃水浴5 min 置冰上, 再加入5×reaction buffer 4 μl, rnaseinhibitor(200万u/l) 1 μl及dntp mix(10 mmol/l) 2 μl, 轻轻混匀后37℃水浴5 min, 再加入1 μl revertaidtmmmulv逆转录酶(200万u/l), 反应混合物在25℃温育10 min后, 37℃水浴60 min, 再70℃加热10 min结束反应后, 冷冻保存于-20℃备用。以上述逆转录cdna为模板, p1、 p2为上下游引物扩增higg1fc段基因, 反应条件为: 95℃预变性5 min后, 以94℃变性1 min, 56℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 为1个循环, 共32个循环, 最后再于72℃延伸10 min。
1.2.3 重组pcdna3.1higg1fc的构建 higg1fc段pcr产物纯化后与pcdna3.1载体分别经ecor i和xho i双酶切37℃, 4 h, 65℃水浴灭活20 min, 割胶回收酶切后的目的片段, 连接转化感受态细菌; 筛选阳性克隆经质粒pcr、 限制性酶谱分析及测序分析确证。
1.2.4 pcr法扩增小鼠ox40胞外段 以本室构建鉴定并保存的pires2egfpox40重组质粒为模板, 以p3、 p4为上下游引物扩增小鼠ox40胞外段基因, 反应条件为: 95℃预变性5 min后, 94℃变性55 s, 55℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 为1个循环, 共30个循环, 最后再于72℃延伸10 min。
1.2.5 真核表达载体pcdna3.1mox40ig的构建 小鼠ox40胞外段pcr产物纯化后与测序正确的pcdna3.1higg1fc重组质粒分别用bamh i和ecor i进行双酶切, 37℃, 4 h后置65℃灭活20 min, 16℃连接过夜, 转化感受态dh5α菌株, 筛选阳性克隆即重组真核表达载体pcdna3.1mox40ig; 重组质粒分别经质粒pcr、 限制性酶谱分析及测序分析证实。
1.2.6 表达mox40ig的cho细胞株的构建及稳定转染 将pcdna3.1mox40ig重组质粒以脂质体法转染96孔板中已70%～80%融合的cho细胞。转染48 h后, 置于含g418的选择培养液中, 筛选培养2周后再用有限稀释法挑取阳性克隆。
1.2.7 rtpcr检测外源ox40ig mrna的表达 收集g418抗性细胞, trizol法抽提总rna, 逆转录获得cdna后分别以p3+p4、 p3+p2、 p1+p2为上下游引物进行pcr扩增, 琼脂糖电泳测定扩增产物。
1.2.8 夹心elisa法检测上清中mox40ig融合蛋白的表达 用10 mg/l的羊抗人igg包被酶标板, 酶标抗体为hrp标记鼠抗人iggfc mab, 同时以正常人igg为阳性对照, 以转染有pcdna3.1空载体的细胞培养上清为阴性对照。
1.2.9 蛋白a亲和层析柱纯化及纯化蛋白的鉴定 样品的纯化按说明书进行。sdspage完毕后以考马斯亮蓝g250染液染色, 鉴定纯化后mox40ig融合蛋白的分子量。
1.2.10 小鼠b淋巴细胞的制备 小鼠眼球放血处死, 无菌取脾脏, 移入滤网中研磨, 用ficoll分离单个核细胞。pbs洗后, 贴壁2 h去除贴壁细胞, 吸出富集的b细胞备用。
1.2.11 淋巴细胞增殖试验 将反应b细胞按1×105个/孔的浓度加到预先用抗小鼠migm激发型抗体（1 mg/l）包被的96孔板中, 同时加入或不加入抗小鼠cd40激发型抗体（1 g/l）。培养2 d后, 分别加入1∶10、 1∶20、 1∶40倍比稀释的纯化 mox40ig, 同时设阴性对照（不同浓度的人igg）, 空白对照（含100 ml/l fcs 的rpmi1640培养液）, 每组设5个复孔。在37℃、 50 ml/l co2培养箱中共培养2 d, 加入3htdr(0.5μci/孔), 于37℃共育16h。将细胞收集于24nm玻璃纤维纸片上, 使用β液体闪烁计数器测定每个样品的cpm值。
1.2.12 统计学处理 采用sas8.0软件对数据进行单因素方差分析和多元方差分析。
2 结果
2.1 higg1fc段基因的扩增及重组载体pcdna3.1higg1fc的构建 rtpcr法从正常人外周血单个核细胞中扩增出约650 bp的higg1fc段基因（图1）, 重组载体经pcr、 限制性酶谱分析后（图2）进行dna测序。结果显示, 所获得的higg1fc段基因序列与genbank中报道的序列完全一致。
图1 rtpcr法扩增人igg1fc段基因电泳检测（略）
fig 1 the agarose electrophoresis of rtpcr product of human igg1fc gene
1: dna marker; 2: cdna fragment encoding the human igg1fc; 3: βactin.
图2 重组载体pcdna3.1higg1fc的酶切鉴定（略）
fig 2 results of recombinant pcdna3.1higg1fc digested by ecor i plus xho i
1: dna marker; 2: pcdna3.1higg1fc/ecor i+xho i; 3: pcdna3.1; 4: pcdna3.1higg1fc.
2.2 小鼠ox40胞外段的扩增及真核表达载体pcdna3.1mox40ig的构建 pcr法扩增获得的小鼠ox40胞外段基因约690 bp左右（图3）, 重组真核表达载体pcdna3.1mox40ig经质粒pcr（图4）、 限制性酶谱分析（图5）后进行dna测序。结果显示, 所获得的小鼠ox40胞外段及higg1fc段基因序列均与genbank中报道的序列完全一致, 并且拼接后的小鼠ox40胞外段及higg1fc段基因未发生移码突变。
图3 pcr扩增小鼠ox40胞外段基因电泳检测（略）
fig 3 amplification of mouse ox40 extracellular gene by pcr
1: dna marker; 2: mouse ox40 extracellular gene.
图4 重组载体pcdna3.1mox40ig的pcr鉴定结果（略）
fig 4 pcr analysis of recombinant pcdna3.1mox40ig
1: the human igg1fc gene; 2: dna marker; 3: mouse ox40 extracellular gene; 4: mox40＋higg1fc.
图5 重组载体pcdna3.1mox40ig的酶切鉴定（略）
fig 5 restrictive enzyme digestion analysis of recombinant pcdna3.1mox40ig
1: λdna/ecor i+hind iii marker; 2: pcdna3.1mox40ig; 3: pcdna3.1mox40ig/ecor i+xho i; 4: pcdna3.1mox40ig/bamh i+xho i; 5: pcdna3.1mox40ig/hind iii+xho i; 6: dna marker.
2.3 mox40ig的表达、 纯化及鉴定
2.3.1 rtpcr检测 将鉴定正确的pcdna3.1mox40ig以脂质体法转染cho细胞, 经g418筛选获得稳定表达mox40ig的细胞株。rtpcr鉴定表明, 从cho/mox40ig细胞中能扩增出小鼠ox40胞外段（约650 bp）、 higg1fc（约690 bp）及mox40ig（约1330 bp）特异性条带; 而转染pcdna3.1的细胞样品未扩增出特异性条带（图6）。
图6 稳定表达mox40ig的cho的rtpcr鉴定（略）
fig 6 identification of mox40ig stably expressed cho by rtpcr
1: dna marker; 2-4: the cho cells transfected with pcdna3.1mox40ig; 5: the cho cells transfected with pcdna3.1.
2.3.2 转染细胞上清的双抗体夹心elisa法检测结果 为了检测上清中是否有mox40ig融合蛋白的表达, 我们建立了一种针对mox40ig融合蛋白中fc段的夹心elisa检测法。阴性对照为转染有pcdna3.1空载体的细胞培养上清, 阳性对照为纯化的人igg。结果显示: 阳性转染细胞上清与阳性对照的a490值接近, 其与阴性对照组及空白调零组（pbst）的差异均有统计学意义（p<0.01）。我们认为据此可初步判定上清中有目的蛋白—可溶性mox40ig融合蛋白的表达。取1次收集的上清原液作一系列倍比稀释后夹心elisa检测结果如图7所示。
图7 夹心elisa检测mox40higg1fc的表达（略）
fig 7 confirmation of the fusion protein mox40ig expression by sandwich elisa assay
2.3.3 mox40ig融合蛋白表达的sdspage鉴定 收获pcdna3.1mox40ig转染cho细胞培养上清, 经蛋白a纯化后, 取20 μl在还原条件下进行sdspage分析, 结果显示: 在还原条件下, 转染有pcdna3.1mox40ig的细胞上清纯化后可见有一mr位于66.2 ×103～43×103之间的特异性蛋白带（图8）, mox40ig融合基因编码434个氨基酸, 切除可能的含19个氨基酸的信号肽后, 还剩415个氨基酸, mr 46.3×103（单体且未糖基化时）。考虑到真核表达过程中糖基化对分子量的影响, 可认为与估计的mr 46.3×103基本相符。
2.4 mox40ig融合蛋白对b细胞的体外促增殖作用 mox40ig融合蛋白能有效促进b细胞增殖, 说明我们获得了有生物学活性的mox40ig融合蛋白, 并且随着其浓度的增高, 促增殖效应越明显, 但其作用强度不如抗cd40 mab明显（p<0.05）, 两者联合应用的促增殖效应较单独应用mox40ig融合蛋白或抗cd40 mab均具有统计学意义（p<0.05, 图9）。
图8 mox40ig融合蛋白的sdspage鉴定（略）
fig 8 identification of relative molecular weight of the fusion protein mox40ig
图9 mox40ig对小鼠b细胞的体外促增殖作用（略）
fig 9 the influence on b cell proliferation stimulated with mox40ig in vitro
3 讨论
ox40/ox40l是免疫应答过程中一对重要的协同刺激分子, 它们的相互作用能促进cd4+t细胞的活化、 增殖、 迁移, 延长其寿命, 并促进生发中心的形成和dc的分化成熟。ox40（cd134）, 是tnfr超家族成员之一, 为i型跨膜糖蛋白, 属活化后诱导表达, 即只表达于活化的t细胞表面, 且主要是cd4+t细胞, cd8+t细胞表面有少量表达[5]。表达ox40的t细胞只在炎症处存在, 其阳性t细胞是抗原特异性t细胞, 在外周血中不存在, 其表达时相较晚且短暂, 这些特点成为其治疗由t细胞介导的多种自身免疫性疾病及防治移植排斥的有利条件。除此之外, 在对免疫耐受影响的研究中发现, 许多共刺激分子都可以阻止耐受的形成, 而耐受一旦形成, 只有ox40可以打破已建立的外周耐受[6], 从而可以打破肿瘤的免疫耐受, 恢复免疫监视。以往研究显示, ox40/ox40l在机体的免疫应答和多种疾病中均起重要作用, 而通过对ox40及其配体相互作用的干预可能是治疗多种人类疾病的有效途径之一[7]。
有研究显示, ox40胞外段与各种igg的fc段融合构建的融合蛋白中, 与igg1的fc段融合所构建的融合蛋白与ox40l结合的亲和力最强[8]。本研究中, 我们将ox40胞外段与igg1fc段融合构建了pcdna3.1mox40ig真核表达载体, 转染cho细胞后, 经rtpcr、 双抗体夹心elisa及sdspage分析证实我们获得了mox40ig融合蛋白的分泌性表达。同时, 我们对mox40ig融合蛋白的功能进行了初步的体外研究。 3htdr掺入试验表明, 分泌表达的mox40ig融合蛋白能够明显促进b细胞增殖, 若将其与抗cd40 mab共同作用于b细胞, 其促增殖作用更为明显。本研究中我们成功地构建了pcdna3.1mox40ig真核表达载体, 将其转染cho细胞, 获得了可溶性mox40ig融合蛋白的稳定表达, 并进行了初步的鉴定和生物学活性检测, 为进一步研究ox40分子在移植耐受的诱导及自身免疫病治疗中的作用打下良好的基础。
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