【摘要】 目的: 研究hpv18 e2及其n端(tad)、 c端(dbd)与gfp融合蛋白瞬时高表达对巨噬细胞（mφ）凋亡及分泌活性的影响, 为进一步研究e2蛋白在hpv18致癌机制中的作用奠定实验基础。方法: 通过pcr从现有真核表达载体pegfpc1/e2上分别扩增出tad、 dbd基因片段, 并构建真核表达载体pegfpc1/tad、 pegfpc1/dbd。将3种真核表达载体及pegfpc1分别转染mφ, 用倒置荧光显微镜观察它们的表达与定位, 并以抗gfp抗体为一抗作western blot检测它们的表达。通过3种融合蛋白在mф内的瞬时高表达, 在转染48 h后分别检测各组细胞培养基中tnfα和il1β的含量, 并收集mφ经染色以及流式细胞术（fcm）观察检测其凋亡。结果: gfpe2融合蛋白主要表达于细胞核, 细胞质内也有表达, 而gfpdbd融合蛋白仅表达于细胞核内, gfptad仅表达于细胞质。gfpe2、 gfptad融合蛋白在mφ内高表达后mφ凋亡率上升, 细胞因子tnfα和il1β分泌量增加, 且gfptad作用强于gfpe2。而egfpdbd无此作用。结论: hpv18 e2及其tad与egfp融合蛋白瞬时高表达可诱导mφ凋亡并上调其分泌细胞因子tnfα和il1β。
【关键词】 人乳头瘤病毒18型 e2蛋白 巨噬细胞 凋亡 细胞因子
[abstract] aim: to study the effect of the over expression of gfpe2, gfptad(nextremity domain of hpv18 e2) and gfpdbd (cextremity domain of hpv18 e2) on the apoptosis and secretion of macrophages and to further explore the contribution of e2 gene to the uterine cervix cancer. methods: tad or dbd gene was amplified from pegfpc1/hpv18 e2 by pcr respectively and then cloned into pegfpc1 vector. after the transfection of recombinant plasmids or pegfpc1 into the macrophages, their expression was examined by fluorescent microscopy and western blot. the cytokine content of tnfα or il1β in the culture medium was tested quantitatively with elisa kit respectively. the stained macrophages were observed and their apoptosis rate was tested by flow cytometry. results: after transfected into macrophages, gfpe2 fusion protein was mainly located in cytoplasma while gfpdbd fusion protein was completely located in nuclei and gfptad fusion protein was completely located in cytoplasma. the overexpression of gfpe2 or gfptad increased the level of tnfα and il1β and upregulate the apoptosis rate of macrophages. furthermore, the effect of gfptad was obvious except on il1β level but the overexpression of gfpdbd did not show the same effect. conclusion: the overexpression of gfpe2 or gfptad fusion protein can induce the apoptosis macrophages and upregulate tnfα or il1β secretion of macrophages.
[keywords]hpv18; e2 protein; macrophage; apoptosis; cytokine
人乳头瘤病毒（human papillomavirus, hpv）高危型如hpv16、 18等常引起重度不典型性增生,甚至恶性肿瘤[1]。wWw.11665.cOmhpv18是一种无包膜的环状病毒, 基因全长7900 bp, 早期基因区编码的e2蛋白由365个氨基酸组成, 分为2个结构域: n端转录活化结构域（transactivation domain, tad）, 由206 aa组成; c端dna结合域（dnabinding domain, dbd）, 由80 aa组成; 中间是一个可变的铰链区（hinge）, 由79 aa组成[2]。e2蛋白既调节病毒的转录又调节病毒的复制, 且通过多种途径影响细胞增殖。目前国内外有不少学者将e2蛋白用来研发hpv疫苗。
mφ是机体抗肿瘤免疫中的重要效应细胞, 激活的mφ可分泌tnfα、 il1β等细胞因子直接杀瘤或抑制瘤细胞生长。hpv感染后, 在真皮基质可检测到大量的巨噬细胞。尖锐湿疣患者外周血tnfα水平明显高于正常对照组[3], hpv感染者血浆及宫颈分泌物中il1β水平也升高[4]。本实验中我们通过检测hpv18 e2蛋白及其tad、 dbd高表达对mφ凋亡及其分泌tnfα和il1β的影响, 为hpv18致癌机制以及e2蛋白相关疫苗的研究奠定前期实验基础。
1 材料和方法
1.1 材料 真核表达载体pegfpc1、 pegfpc1/hpv18 e2由法国巴斯德研究所francoise thierry教授惠赠; e.coli jm109由本室保存; 人单核细胞白血病thp1细胞购自中国典型培养物保存中心（武汉）; 低温高速离心机是hettich公司产品; 倒置荧光显微镜是日本nikon公司产品; 全自动酶标仪是芬兰雷勃公司产品; 限制性核酸内切酶、 t4 dna连接酶、 佛波脂购于深圳晶美生物公司; sofasttm转染试剂购于夏门太阳马生物有限公司; 兔抗gfp抗体购于ebioscience公司; hrp标记羊抗兔igg购自solarbio公司; tnfα和il1β定量检测试验盒购于上海森雄科技实业有限公司。
1.2 方法
1.2.1 pegfpc1/tad、 pegfpc1/dbd重组载体的构建 分别设计上、 下游含限制性核酸内切酶ecor i、 bamh i酶切位点的2对引物。p1: 5′gtagaattccatggagacaccgaaggaaac3′和p2: 5′cccggatccactgcacatagagtcattac3′; p3: 5′gcgaattccactacgcctataatac3′和p4: 5′gccggatccttacattgtcatgtatc3′。以pegfpc1/e2为模板, 通过pcr分别扩增出tad、 dbd基因片段。以ecor i、 bamh i双酶切tad、 dbd及空载体pegfpc1, 用t4 dna酶过夜连接, 转化e.coli jm109并提取质粒, 酶切鉴定后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
1.2.2 重组质粒在mφ中的表达与定位 悬浮细胞thp1在体外培养经佛波脂（pma）活化后可分化为贴壁的mφ[5]。转染前3 d, thp1细胞用按0.4×109细胞/l转入24孔板, 每孔1 ml, 培养24 h后加入终浓度为40 μg/l的pma诱导48 h。用新鲜培养基洗涤细胞后每孔分别加入3种重组质粒及pegfpc1各0.5 μg, 同时作空白对照, 用sofasttm转染试剂按说明书转染细胞。细胞转染后6 h, 用新鲜培养基洗涤2次, 每孔加1 ml培养基继续培养。用倒置荧光显微镜观察绿色荧光的表达与定位, 在表达荧光细胞数量最多时收集细胞, 置4℃下加入50 μl细胞裂解液30 min, 10000 r/min4℃离心5 min, 收获细胞裂解上清液经sdspage后, 以抗gfp抗体为一抗作western blot鉴定。
1.2.3 重组质粒高表达对mφ凋亡及其分泌活性影响的测定 按上述方法转染细胞, 每组设6个复孔, 然后于表达荧光细胞数量最多时取培养液100 μl, 用tnfα和il1β定量elisa试剂盒按说明分别测定a492值, 求出tnfα和il1β含量(ng/l)。同时取每组前3孔细胞作giemsa染色, 显微镜下观察各组mφ的形态变化, 并收集后3孔mφ于1.5 ml ep管中, 加入1 ml700 ml/l乙醇4℃过夜后由
2 结果
2.1 重组质粒的鉴定 双酶切重组质粒琼脂糖电泳结果见图1。经测序证明重组质粒分别含有618 bp、 243 bp的目的基因片段, 无碱基错配和移码突变, 且分别与hpv18 e2 tad和dbd读码框完全一致（数据未显示）。
图1 pegfpc1/dbd重组质粒的鉴定（略）
fig 1 enzymatic digestion of pegfpc1/tad and pegfpc1/dbd recombinant
1: 100 bp dna marker; 2: pegfp-c1/tad cut with bamh i and ecor i; 3: tad dna fragment; 4: pegfpc1/dbd cut with bamh i and ecor i; 5: dbd dna fragment; 6: pegfpc1 cut with bamh i and ecor i; 7: dna marker dl 15000.
2.2 重组质粒在细胞中的表达与定位 经倒置荧光显微镜观察, 重组质粒的表达定位如图2, gfpdbd融合蛋白完全表达定位于细胞核内, gfptad完全表达定位于细胞质, gfpe2、 gfp在细胞核、 细胞质内均有表达, 但gfpe2表达组细胞核荧光亮度强于细胞胞质, gfp在细胞核质内呈均匀表达。转染48 h后发荧光细胞数量最多, 收集此时的细胞裂解, western blot结果（图3）, 图3中相对分子质量(mr)约29400、 53400、 70700、 38600的条带分别与预期gfp、 gfptad、 gfpe2、 gfpdbd大小一致。
图2 重组质粒在细胞中表达的荧光显微照片（略）
fig 2 fluorescent microscopical photos of cells expressing(×400)
图3 重组质粒在mφ表达产物的western blot分析（略）
fig 3 western blot result of macrophages transfected by one kind of recombinant plasmids
1: macrophages lysate; 2: macrophages lysate transfected by pegfpc1; 3: macrophages lysate transfected by pegfpc1/tad; 4: macrophages lysate transfected by pegfpc1/e2; 5: macrophages lysate transfected by pegfpc1/dbd.
2.3 重组质粒高表达对mφ分泌活性的影响 于48 h测各组培养液中tnfα和il1β含量, 将每组6个数据经spss13.0软件统计分析, 结果（图4）显示: gfpe2、 gfptad表达组2种细胞因子含量均明显升高, 与对照组比较有统计学意义(p<0.001)。gfpe2与gfptad之间tnfα浓度也有统计学意义（p<0.05）, gfptad表达组tnfα浓度大于gfpe2表达组; il1β浓度无统计学意义（p>0.05）。gfpdbd、 gfp瞬时高表达对2种细胞因子的分泌均无统计学意义。
图4 细胞培养基上清中tnfα和il1β的浓度（略）
fig 4 the level of tnfα or il1β in the cell culture medium
2.4 重组质粒高表达对mφ凋亡的影响 于48 h后取各细胞作giemsa染色, 镜下观察如图5所示: 对照组和gfp、 gfpdbd表达组大部分mφ中等大小, 单个散在, 梭形或多角形, 折光性好, 呈正常细胞形态。gfptad、 gfpe2表达组部分mφ体积变小、 变圆, 细胞聚集, 胞质浓缩, 核浓染, 部分细胞溶解、 核碎裂, 呈现凋亡细胞形态。
fcm检测各组细胞凋亡率, 将每组3个数据经spss13.0软件统计分析, 结果: gfpe2、 gfptad表达组(n=3)mφ凋亡率明显升高, 与对照组(n=3)比较有统计学意义[(11.99±0.58)% vs (4.48±0.55)%、 (13.89±0.83)% vs (4.48±0.55)%, p<0.001]。gfpe2与gfptad之间mφ凋亡率有统计学意义[(11.99±0.58)% vs (13.89±0.83)%, p<0.05]。gfpdbd、 gfp瞬时高表达组（n=3）mφ凋亡率与对照组比较无统计学意义[(4.87±0.69)% vs (4.48±0.55)%、 (4.58±1.15)% vs (4.48±0.55)%]。
图5 giemsa染色的各组mφ（略）
fig 5 the giemsa stain of macrophages in different groups(×400)
3 讨论
在与hpv18 相关的宫颈癌中, 常发现其dna整合于宫颈癌细胞基因组, 但在该整合过程中, 通常存在e2基因的缺失, 缺少e2蛋白的表达是hpv18所致宫颈癌的一个重要标志。而且, 在hpv18感染的宫颈癌细胞中, 重新引入e2基因可以抑制hpv致癌基因e6、 e7的表达, 使细胞周阻滞止于g1期, 细胞发生衰老或凋亡[6]。这些结果表明, hpv18 e2蛋白在癌变过程中可能发生负调控的作用。
mφ是重要免疫细胞, 具有较强吞噬和杀伤能力, 可调控局部细胞微环境及抑制肿瘤, 并能提呈抗原和产生tnfα、 il1β等细胞因子, 参与机体特异性免疫应答。本研究中我们将hpv18 e2及其tad、 dbd与egfp融合蛋白载体在mφ中瞬时高表达发现, gfpdbd融合蛋白完全表达于细胞核内, gfptad完全表达于细胞质, gfpe2、 gfp在细胞核、 质内均有表达, 但gfpe2主要表达于细胞核内。该现象与blachon等[7]的研究结果相一致, hpv18 e2蛋白n端结构域含有一段核输出序列（nuclear export sequence, nes）, c端结构域含有一段核定位序列（nuclear localization sequence, nls）。同时, 我们发现gfpe2、 gfptad瞬时高表达, 可上调mφ分泌tnfα和il1β, 并诱导mφ凋亡, 且除il1β外, gfptad的作用均强于gfpe2, 原因可能是由于在细胞内定位的不同导致其作用的差异。而gfpdbd、 gfp瞬时高表对mφ的分泌和凋亡均无显著性影响, 这表明在无hpv感染的mφ中, 起作用的是e2蛋白n端结构域。tnfα与肿瘤细胞凋亡密切相关, 当mφ分泌tnfα的量显著升高时, 也有可能影响mφ的凋亡率。适量的tnfα介导的免疫反应对机体具有保护作用, 它可抑制病毒复制, 选择性破坏病毒感染细胞, 但过量的tnfα则会引起机体的损伤。在宫颈上皮内瘤变前期e2蛋白高表达, 而后期病变和高度恶性的宫颈癌中, 存在e2蛋白去表达及e6、 e7癌蛋白的高表达的现象[8], 本实验中我们发现gfpe2、 gfptad在体外培养的mφ中瞬时高表达上调其tnfα和il1β分泌水平, 因此我们推测e2蛋白对hpv感染者体内细胞因子水平的改变以及免疫应答方面起重要作用, 但hpv18 e2蛋白上调mφ分泌tnfα对机体起何种作用及其机制目前尚不清楚, 有待进一步研究。
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