摘要：利用光学显微镜和电子显微镜对利玛原甲藻（procentrum lima）形态特征及生活史进行了观察。结果表明，其细胞呈卵圆形，长33～44 μm，宽23～33 μm，壳孔62～87个，边缘刺胞孔52～68个。同时，对其生活周期及生殖方式进行了追踪观察，不同的生活周期存在着不同的细胞形态。二分裂是利玛原甲藻主要的分裂方式，并首次发现利玛原甲藻疑似横分裂、出芽生殖的生殖方式。利玛原甲藻面对不良环境时会形成薄壁囊胞。
　　关键词：利玛原甲藻（procentrum lima）；形态特征；生活史；无性生殖；有性生殖
　　中图分类号：p745；s917.3 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2013）11-2607-05
　　利玛原甲藻（procentrum lima）是一种能产生毒素的底栖附生甲藻，分布于热带和温带沿海水域，是构成海洋生态系统的基础，是浮游动物的食物来源[1-5]。利玛原甲藻具有特殊的生理机制，能产生一系列的次生代谢产物，如腹泻性贝毒。该毒素被鱼、虾、贝摄食后在其体内积累，并通过食物链传递至人类，引起腹泻性中毒。腹泻性贝类中毒现象普遍存在，已被列为世界食品卫生学重要问题之一，并引起世界上许多国家及相关国际组织高度重视。除了带来食品安全隐患外，腹泻性贝毒还具有抑制蛋白磷酸酶活性、遗传毒性、促癌活性、促瘤活性、抑癌和抗瘤活性、药理活性等特性[6-9]。
　　目前，对利玛原甲藻形态、生长、生理、产物化学结构等方面有许多研究[1-5，10-17]。然而，有关利玛原甲藻生活史及其环境关系方面的研究还未见报道。www.11665.CoM球状棕囊藻生活史中共有4种不同类型的单细胞，不同的细胞能够适应不同的环境，占据不同的生态位，有利于棕囊藻细胞的生长[18]。孢囊是藻类处于不良环境时形成的一种细胞形态，被认为是赤潮发生的“种源”之一[19，20]，对赤潮的发生、延续和消亡过程有着重要的作用。利玛原甲藻是否亦存在多种细胞类型？这些不同类型的细胞与环境存在什么联系？利玛原甲藻是否也能形成孢囊，作为形成赤潮的潜在因素？本研究对利玛原甲藻生活史进行了观察，为进一步研究利玛原甲藻与环境的关系打下基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　利玛原甲藻采自海南省三亚市，经分离纯化后，保存于中国科学院南海海洋研究所广东省海洋药物重点实验室保种室。利玛原甲藻在温度30 ℃、盐度35‰、光照强度3 500 lx、光照周期13 h∶11 h的环境条件下采用改良k培养液培养。
　　1.2 形态观察
　　1.2.1 光学显微镜观察 吸取利玛原甲藻培养液至nikon-ts100倒置显微镜下观察并拍照。
　　1.2.2 电子显微镜观察 取20 ml利玛原甲藻培养液，加入4%甲醛固定24 h，800 r/min离心5 min后弃上清；加入ddh2o洗涤后，800 r/min离心5 min后弃上清以去盐；加入2 ml 50%锇酸固定4～6 h；800 r/min离心5 min后弃上清，加ddh2o再洗涤，重复3次以去除锇酸。离心后的沉淀物分别进行乙醇梯度（30%、50%、70%、90%、95%）脱水处理。保持湿润状态进行电镜前处理，加入适量乙酸异戊酯置换乙醇，然后用液体co2进行常规干燥。干燥后轻柔抖动滤纸，使藻末散落至胶膜上，hitachi e-1010型离子溅射仪喷镀金膜，用hitachi s-3400n扫描电镜观察并摄影。
　　1.3 生活周期及生殖方式观察
　　将藻株接种至新鲜培养基中，培养方法按照“1.1”方法，每天定时取样观察并拍照。
　　2 结果与分析
　　2.1 光学显微镜及电子显微镜下利玛原甲藻的形态
　　利玛原甲藻在光学显微镜下呈黄绿色、卵圆形，细胞中央的淀粉核清晰可见，周围散布着颗粒状的淀粉粒和叶绿体（图1a）。淀粉核与顶孔之间可见大液泡（图1b），指数生长初期大液泡尤为明显。细胞内容物外泄后形成空壳（图1c），壳板上刺胞孔隐约可见，边缘刺胞孔绕细胞外围整齐排列。利玛原甲藻由左、右两个壳板组成（图1d），壳板厚而光滑，表面分布着壳孔。边缘刺胞孔均匀分布在壳板的四周，边缘刺胞孔是利玛原甲藻区别于其他原甲藻的重要特征。壳板连接至边缘刺胞孔处表面光滑，无壳孔分布（图1e、1i）。右壳板顶端的v形凹陷是其明显的标志（图1f）。v形顶孔由8个小板、1个较大的鞭毛孔及1个较小的辅孔组成（图1g），两根鞭毛由鞭毛孔处伸出，突起的鞭毛骨架包围着辅孔，顶孔至壳板中央的中轴稍有凹陷，壳板中央无刺胞孔。左壳板与右壳板不同，在顶端无v形凹陷，只有个扁平的顶脊区与鞭毛孔相连，中

轴处未下凹，其中央的一小片区域也没有刺胞孔的分布（图1h）。利玛原甲藻侧面图呈扁圆形，细胞长33～44 μm，宽23～33 μm，壳孔62～87个，边缘刺胞孔52～68个。
　　2.2 利玛原甲藻的生活周期
　　指数生长期的利玛原甲藻液泡特别明显（图2a），与稳定期的利玛原甲藻相比，绝大部分的细胞有既大又亮的液泡，而且常常不止1个。由于液泡是物质的存储场所，在指数生长初期，细胞内合成的各种为分裂所准备的物质大多存储在液泡内，使得此时的液泡既大又亮。指数生长初期亦可见某些细胞底部膨大，呈梨状，染色体所在位置颜色明显加深（图2b）。当利玛原甲藻到达稳定期时，由于营养匮乏，有的细胞会发生壳壁分离，处于休眠状态（图2c）；也有的细胞会发生内容物外泄（图2d）。内容物外泄后的细胞颜色变淡或无色（图2e），左右壳板会发生分裂（图2f）。此外，在稳定期常常看到1对细胞被包裹在透明的囊膜里（图2g），这是为了适应不良环境而形成的，稳定期水体中的营养成分不足以维持新生细胞的生长需要。生长末期，细胞颜色变深，形状变得不规则，淀粉核消失，边缘刺孢孔变得不明显（图2h、2i）。
　　刚接种时（延滞期），大多数细胞紧贴在瓶底，只有极少的细胞连接形成絮状悬浮（图3a）。几天后（指数生长前期）贴在瓶底的细胞逐渐适应新环境，部分细胞开始连接在一起，呈悬浮状，由于生长较活跃，会有一些小气泡（图3b）。细胞贴底现象消失，利玛原甲藻在摇动后形成丝状或片状悬浮，并有很多气泡（图3c）。因此，液泡和气泡与利玛原甲藻的细胞分裂密切相关，可作为观察利玛原甲藻生长活跃的标志。稳定期时悬浮细胞减少，绝大部分沉底，没有气泡（图3d）。 　2.3 利玛原甲藻的生殖方式
　　利玛原甲藻既可无性繁殖又可有性生殖，无性繁殖以二分裂为主，也会出现疑似横分裂和出芽生殖的生殖形式。
　　1）利玛原甲藻的二分裂先是进行核分裂，然后进行质分裂。分裂时，两个壳板之间的中间带变宽（图4a），细胞底部出现分叉（图4b），呈“v”形。每个子细胞在分裂过程中均合成1个新壳板，即每个细胞均有1块来自原母细胞的壳板和1块新合成的壳板。当两个子细胞还没分裂完全时，第三个细胞在两个子细胞之间开始形成“爪”形的三胞体（图4c）。顶部鞭毛和游动细胞的出现标志着分裂完成。
　　2）利玛原甲藻培养过程中，发现疑似横分裂的生殖方式。首先是细胞横轴的一端出现凹陷，此时淀粉核消失（图4d），然后另一端也发生凹陷，在细胞底部形成一片颜色较暗的物质（图4e），接着在细胞上、下部分的中央形成两个新的淀粉核（图4f），最后细胞的鞭毛孔与底部处分开（图4g），在将要分离的连接处可看到透明的薄膜。利玛原甲藻疑似出芽生殖的现象首次被发现，小芽孢出自母体接近细胞核的底端，处于母细胞中央的淀粉核清晰可见（图4h、4i）。
　　3）利玛原甲藻的有性生殖是同配生殖。配子外壁脱落后比正常细胞略小，通过受精桥进行固定（图4j），当配子固定后受精桥消失，细胞核从供体转移到受体细胞，接着形成大合子（图4k），该过程与faust[21]的报道一致。休眠细胞处于合子的旁边，呈圆形，约为合子的1/3～1/2，边缘刺胞孔消失，外壁明显变厚。合子的休眠期很短，当原生质出现，合子开始脱孢囊，形成叶绿素，然后胞质分裂（图4l）。
　　3 小结与讨论
　　1）利玛原甲藻整个生活周期存在游离的单细胞和群体细胞两种生活形态。在刚接种的生长初期，密度小、游动的单细胞占优势；到了指数生长期，绝大部分的细胞连接在一起形成丝状或絮状悬浮，群体细胞占了绝对优势；稳定期后期，细胞沉在底部，有游离的单细胞，也有被絮状物黏在一起的群体细胞。利玛原甲藻体积较大，大多数单细胞只能沉在底部缓慢游动，影响光吸收，而细胞连接成丝或絮状悬浮在培养液中，大大有利于光合作用。因而悬浮的细胞群体常常伴随有较多较大的气泡。
　　2）利玛原甲藻的生殖方式较为复杂，在生长前期营养良好的环境条件下以无性繁殖为主，在生长后期营养较匮乏时可观察到有性繁殖。不同藻类主要生殖方式不同，有性生殖是球状棕囊藻主要的生殖方式[18]，而利玛原甲藻主要生殖方式是无性生殖。有毒赤潮藻种（pfiesteria piscicida）无性生殖的分裂发生在孢囊里，并非由游动细胞直接分裂而来[22]，拟膝沟亚历山大藻（alexandrium pseudogonyaulax）也可以形成暂

时性孢囊进行分裂[23]。利玛原甲藻无性生殖方式有发生在暂时性孢囊里的分裂，也有由游动细胞直接产生子细胞的分裂。
　　3）目前，对甲藻生活史研究较多的是孢囊。甲藻孢囊的形成有利于营养细胞在不良环境下度过逆境阶段，而且比营养细胞和休眠细胞更有利于抵御浮游动物的捕食， 甚至随浮游动物的粪便排出后仍可萌发，这些现象对于赤潮的引发、种群的保存、延续以及分布扩散等均具有重要的生物学和生态学意义[24，25]。孢囊形成一般认为受营养盐和温度两方面因素的影响。野外采集观察发现孢囊形成常是由于温度降低所诱导，低氮营养可诱导孢囊形成已被室内培养所证实[26-28]。本研究中利玛原甲藻恒温培养，孢囊是在生长稳定期或者末期被观察到，因此，其孢囊的形成与营养盐的缺乏密切相关。
　　本研究对利玛原甲藻生活史展开追踪和观察，较为全面地观测和记录到其生活形态和生殖方式。多个细胞裹在一个孢囊的繁殖方式或许能加快种群的繁殖速度。首次发现疑似横分裂、出芽生殖这些独特的生殖方式和休眠细胞，丰富了细胞形态学和利玛原甲藻生活史的研究。
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