[摘要] 目的 研究涎腺良性肿瘤组织、恶性肿瘤组织和涎腺炎症中人β-防御素-2（hbd-2）mrna和蛋白的表达特征。方法 对不同涎腺组织，采用聚合酶链反应（pcr）、实时聚合酶链反应（real-time pcr）和免疫组化检测hbd-2的表达，并分析hbd-2 mrna和蛋白在涎腺良性肿瘤组织、恶性肿瘤组织、炎症组织和正常涎腺组织中的表达差异。结果 与涎腺正常组织比较，良性肿瘤组hbd-2 mrna表达量为其6.468倍，显著高于涎腺正常组织组（p<0.05）；恶性肿瘤组为其0.334倍，显著低于涎腺正常组织组（p<0.05）；涎腺炎症组为其10.563倍，显著高于涎腺正常组织组（p<0.05）。hbd-2不仅在这些组织的细胞质中有表达，而且在恶性组织中的细胞核也有表达。结论 hbd-2在涎腺良性肿瘤组织及涎腺炎症组织中高表达，在涎腺恶性肿瘤组织中低表达，其蛋白发生核转移。
　　[关键词] 人β-防御素-2； 涎腺肿瘤； 涎腺炎症
　　[中图分类号] q 786 [文献标志码] a [doi] 10.7518/hxkq.2013.05.017
　　在我国涎腺肿瘤占人头颈部肿瘤的2%～3%[1]，发病率比较高，常发生在主要的腺体中。β-防御素属于抗菌肽（antimicrobial peptides，amps），在天然免疫过程中表现多种作用，属于固有免疫系统，对于抗原呈递的树突细胞具有诱导刺激作用[2]。最近人β-防御素-2（human beta-defensin-2，hbd-2）被认为是位于染色体8p23上的备用肿瘤抑制基因，hbd-2基因在一系列细胞中的超表达导致细胞凋亡蛋白-3调控细胞凋亡或者是细胞的完全死亡通过特殊的细胞表面受体来调节[3]。WWW.11665.COmhbd-2首先在牛皮癣患者的皮肤中被发现，还表达于包皮、肺、气管、口腔黏膜等组织[4]，hbd-2通过上皮表面分泌的一种小的可溶缩氨酸发挥抗菌作用。hbd-2能被细菌、细菌毒性产物以及诸如白细胞介素（interleukin，il）-
　　1β、il-16、il-8或者肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，tnf-α）等细胞因子诱导，此外合成的hbd-
　　2能抑制膀胱癌细胞系tsu-pr1的增殖，可导致肾癌细胞的凋亡[5]。在90%的肾癌细胞和82%的恶性前列腺癌中都发现有hbd-2的减少，而在良性的上皮瘤中有持续的高表达[6]。本实验旨在研究hbd-2 mrna和蛋白在涎腺良性肿瘤组织、恶性肿瘤组织、炎症组织和正常涎腺组织中的表达情况，及其在这些中的表达位置。
　　1 材料和方法
　　1.1 实验材料
　　trizol（gibco公司，美国），primescript rt mastermix、premixtaq version2.0、实时聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，real-time pcr）sybr premix ex taq（takara公司，日本），免疫组织化学试剂盒（invitrogeng公司，美国），sp免疫组化试剂盒（北京中杉生物技术有限公司）。
　　实验引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。hbd-2的上游引物：5’-catgagggtct-tgtatctcctct-3’，下游引物：5’-cctcctcat-ggctttttgcagc-3’。β-actin的上游引物：5’-aa-actggaacggtgaaggtg-3’， 下游引物：5’-ag-tggggtggcttttaggat-3’。
　　1.2 方法
　　1.2.1 标本采集 选取2008—2010年在北京大学深圳医院经手术和病理证实的涎腺良性肿瘤标本32例，其中男19例，女13例，平均年龄45.7岁。正常涎腺标本23例，其中男13例，女10例，平均年龄43.5岁。恶性肿瘤标本10例，其中男6例，女4例，平均年龄57.6岁。炎症标本16例，其中男10例，女6例，平均年龄52.9岁。所选标本一份保存于液氮中，用于提取rna；一份以4%多聚甲醛固定，4 ℃存放，用于免疫组化检测。以上标本的获得均取得患者知情同意。
　　1.2.2 hbd-2在涎腺良性肿瘤组织、恶性肿瘤组织、炎症组织和正常涎腺组织中的表达 用trizol法从各个标本中提取mrna，按照逆转录试剂盒说明，将mrna逆转录成cdna；将cdna用于premixtaq ver-sion2.0试剂做pcr分析表达情况。并将cdna用于real-time pcr，定量检测hbd-2 mrna表达，具体的步骤参照试剂盒说明。real-time pcr条件：
　　95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃ 5 min。对hbd-2以及内参照β-actin分别进行实时荧光定量pcr扩增，pcr定量计算mrna，待测样品中的表达量用2-△ct表示，2-△ct = 2-（ct目的基因-ct内参基因）。
　　1.2.3 免疫组化 所有的切片均经光学显微镜下盲法评分。随机选择5个高倍镜视野（×400）进行判断，以肿瘤细胞阳性百

数及染色强度进行肿瘤细胞阳性计分，2个分值相加即为该标本的免疫组化阳性计分，具体如下。1）阴性表达或无表达：0～1分；2）弱阳性：2～3分；3）阳性：4～5分；4）强阳性：6～7分。染色强度评分：0分为无色；1分为细胞染色呈浅黄色；2分为细胞呈黄色；3分为细胞呈棕褐色。阳性细胞比例：1%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；76%～100%为4分。规定积分≥3分为阳性，无阳性细胞表达为0。
　　1.3 统计方法
　　采用spss 13.0统计软件对实验数据进行分析，对real-time pcr结果采用χ2检验分析，采用fisher’s exact test计算免疫组化评分结果，并采用continuity correction对上述结果进行校正。 　2 结果
　　2.1 hbd-2的分子检测
　　pcr结果显示，在涎腺良性肿瘤组织、恶性肿瘤组织、炎症组织和正常涎腺组织中均可检测到hbd-2 mrna（图1）。
　　1：marker；2：良性肿瘤组织；3：恶性肿瘤组织；4：炎症组织；5：正常涎腺组织。
　　图 1 涎腺肿瘤组织、炎症组织和正常涎腺组织中均见hbd-2
　　的表达
　　fig 1 the expression of hbd-2 in tumor tissue， inflammation tis-
　　sue and normal salary gland tissue
　　real-time pcr结果显示，与正常涎腺组织组比较，良性肿瘤组hbd-2 mrna表达量为其6.468倍，显著高于正常涎腺组织组（p<0.05）；恶性肿瘤组为其0.334倍，显著低于正常涎腺组织组（p<0.05）；炎症组织组为其10.563倍，显著高于正常涎腺组织组（p<0.05）（图2）。
　　图 2 hbd-2 mrna在涎腺良性肿瘤组织、恶性肿瘤组织、炎
　　症组织和正常涎腺组织中的表达
　　fig 2 the expression of hbd-2 mrna in salary gland benign tu-
　　mor， cancer and inflammation tissue and normal salary
　　gland tissue
　　2.2 hbd-2在不同涎腺组织中的表达
　　免疫组化结果显示，hbd-2蛋白表达于表皮细胞和间质细胞，正常涎腺组织、涎腺良性肿瘤组织和炎症组织中皆可检测到hbd-2表达，但在涎腺恶性肿瘤中阴性表达常见。与正常涎腺组织比较，恶性肿瘤组织hbd-2表达显著降低；炎症组织和良性肿瘤组织hbd-2表达显著增强，表达见于细胞浆区（图3）。将hbd-2阴性表达和弱阳性表达限定为低表达，统计结果显示，hbd-2在涎腺恶性肿瘤组织中的表达明显低于正常组织（p<0.05），并且其表达不仅局限于细胞浆中，在细胞核中也有发现。hbd-2蛋白在涎腺正常组织、炎症组织、良性肿瘤和恶性肿瘤组织中的表达情况见表1。
　　3 讨论
　　存在于人体的防御素分为两类，分别为α-防御素和β-防御素，hbd-2是β-防御素中的一种[7]。防御素在天然免疫功能中表现多种作用，一些报道暗示人类的hbd具有潜在肿瘤抑制作用[8]。本研究发现相对于正常组织，炎症组织hbd-2 mrna的表达量为其10.563倍，良性腺瘤中hbd-2 mrna的表达量为其6.468倍，而在恶性肿瘤中其表达有所下降。免疫组化显示，相对于正常组织，炎症组织、良性肿瘤中hbd-2的表达水平有所上升，恶性肿瘤hbd-2表达有所下降；不仅表达量有变化，表达位置也有改变，正常组织、炎症组织和良性肿瘤中hbd-2仅出现在细胞质中，而恶性肿瘤中其在细胞质和胞核中都有表达。这些数据表明hbd-2可能与涎腺炎症或发生肿瘤时微生物感染、炎症因子的持续刺激、机体为了抵抗微生物入侵[9]、上调hbd-2表达有关。有研究[10]表明， hbd-2的表达可能由炎症刺激因素诱导产生；其次在恶性涎腺肿瘤中除了基因改变外，它也有可能是一种抑制剂，这些都可能在肿瘤的发展中发挥潜在作用。hbd-2作为机体天然免疫系统的组成部分，与某些炎症性疾病和肿瘤的发展有密切的关系。研究[11]发现防御素能够裂解肿瘤细胞，其裂解作用与防御素浓度密切相关，温度下降或有血清存在时被抑制；发现鼠恶性畸胎瘤细胞在体外经人中性粒细胞多肽作用后，回移体内丧失致瘤性[12]。目前已在多种组织的肿瘤中检测出防御素的表达[13]。
　　在研究防御素与口腔疾病的关系时，防御素家族在口腔黏膜宿主防御及免疫应答过程中发挥着重要作用，与多种口腔黏膜疾病（口腔溃疡、扁平苔藓、白斑及口腔白色假丝酵母菌等）关系密切[14]，口腔内龋齿的发生也与β-防御素的表达有关[15]。
　　在口腔肿瘤学方面，abiko等[16]报道在涎腺角化肿瘤中的hbd缩氨酸意味着腺管细

胞在炎症和癌症的角化作用情况下发生了鳞状上皮化生。此外sawaki等[17]曾经报道口腔鳞状细胞癌有hbd-2存在并且其浓度水平高，部分hbd-2浓度高的患者术后预后较好，有些浓度低的患者可发生3年内转移和复发。wenghoefer等[18]发现很多口腔病变中hbd-2减少，但在口腔鳞状上皮癌中有所增加，认为hbd-2在调控口腔鳞癌凋亡的转录和诱导中扮演着重要角色。
　　笔者目前的研究表明：在恶性涎腺肿瘤与正常组织、涎腺炎症组织和良性肿瘤的比较中，hbd-2基因和蛋白表达下降，hbd-2蛋白发生从胞质到胞核的表达改变。虽然到目前为止这种蛋白核转移的原因和生物学影响都还未知，但是hbd-2在细胞核中的聚集似乎导致了基因表达下降，这些都可能在肿瘤的发展中发挥潜在的作用。
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　　（本文编辑 杜冰）