摘要： 本论文样品采集地于湛江近海海域，利用有机溶剂石油醚，三氯甲烷，正丁醇和乙酸乙酯提取海绵中的化学成分，用凝胶色谱（gpc），气相—质谱联用仪（gc/ms），高效液相和液质联用仪等光谱技术进行鉴定，分析海绵含有的化学成分。实验结果表明，此次采摘的海绵中含有多种化合物，并确实了其中hexanedioic acid bis(2-ethylhexyl) ester、 n-hexadecanoic acid、 1,3-cyclopentanedione、2,4-dimethyl-，1,2-dithiolane-3-pentanoic acid tetradecanoic acid五种化合物，26种化合物的分子量，但还有多种物质还有待进一步分析。
　
　　关键词： 海绵；分离提纯；化学成分

　　0引言
　　海绵中含有丰富的生物活性物质。海绵(marine sponge) 是属于动物界、海绵动物门(spongia)的一类低等多细胞海洋生物。从海水、海底沉积土到海洋动植物,以及一些热泉涌、水热狭缝等,包罗万象的生态圈,造就了海绵共附生微生物一个复杂多样的群体,同时,产生了独特的有别于陆地微生物的多种具有生物活性的次级代谢产物。本研究利用海南丰富的海绵资源，从中筛选出化合物，通过色谱、光谱分析技术鉴定其结构特征，并分析其生物活性。有望筛选出结构与活性不同于其他海洋来源的化合物，为进一步开发新的海洋药物提供生物资源，具有非常重要的意义。
　　1材料方法
　　1.1 材料样品采集地：湛江近海海域。wWW.11665.coM样品处理：从海水中采摘健康的海绵样品后，分别置于无菌塑料袋中，一般在2h内送回实验室处理，不能及时送回实验室的则放于冰盒内低温短时间保存。
　　1.2 试剂与仪器
　　三氯甲烷分析醇广州化学试剂厂产品
　　正丁醇分析醇广州化学试剂厂产品
　　乙酸乙酯分析醇广州化学试剂厂产品
　　石油醚分析醇天津市福晨化学试剂厂产品
　　10ml移液枪
　　hp6890/5973msd 气相色谱—质谱联用仪
　　hplc高效液相仪/氨基酸分析仪（water 2487 dualλ absorbance detector）
　　agilent 1100-esquire hct液质联用仪
　　gpc凝胶渗透色谱仪（分子量测试范围：150—270，000）
　　真空干燥箱dzx—3型（6020b）宁波海曙赛福实验仪器厂
　　1.3 实验方法
　　1.3．1 化合物的提取分离海绵用无菌海水浸洗3遍，然后挤干，以去除表面附着物及夹带的海水微生物。用无菌剪刀进行解剖，用2ml 甘油保存。实验时，用5ml 95%工业酒精浸取3次，每次24小时。提取物冷冻干燥成白色粉末后，将浓缩物分散于5ml水中，再用各2ml，1.5ml，1.5ml石油醚分别提取三次，得可溶物5ml，再用极性逐渐增大的三氯甲烷，正丁醇，乙酸已脂以同样的方法提取三次，各得可溶物5ml，提取余相水溶物5ml。
　　1.3.2 气相—质谱联用仪测定有机相分别取200μl用于气相—质谱连用仪（gc/ms）进行测定分析。色谱条件为： 色谱柱 hp-ffap（30m×0.25mm, 0.25μm）,60°c ，4°c/min→150°c， 6°c/min，250°c，进样温度 250°c，载气 he，分流比 80：1，柱流量 1.0μm/min；质谱条件为：ei源，电离电压 70ev，离子源温度 230°c，扫描范围 40-500aum，进气量 1μl。
　　1.3.3 高效液相色谱测定有机相冷冻干燥后用于高效液相及液质联用仪进行测定分析。高效液相分析仪条件为：分离系统：waters 2695 separations module，色谱柱：waters c－18（3×15mm），柱温：25±5℃，流动相：甲醇，水梯度洗脱，洗脱条件如表1。
　　检 测 器：waters 2487 dual λ absorbance detector，检测波长： 254nm，进样量：6μl，控制系统：waters empower 软件。供试品溶液配制：正丁醇萃取液中加入800μl甲醇，三氯甲烷提取物、石油醚提取物以及乙酸乙酯提取物中加入1.3ml甲醇，混匀后以12000转的转速离心15min。取上层溶液待分析用。
　　1.3.4 液质联用仪测定液质联用仪分析条件为：仪器型号为agilent 1100-esquire hct，色谱柱c18，内径4.60*300mm，流动相甲醇+水梯度洗涤，洗脱条件如表2。
　　对水溶物做凝胶色谱分析，gpc的条件为：示差检测器 waters 1515+2414，两根柱子串联：型号分别是ultrahydrogeltm120和ultrahydrogeltm500，柱温55℃，检测器温度50℃，流动相：水流速：0.6ml/min。

    1.3.5 凝胶色谱测定柱子型号：ultrahydrogeltm500、ultrahydrogeltm120（分子量范围100～40万，双柱串联）。填料：葡聚糖。柱温55℃。流动相：纯水。流动相速度：0.6ml/min。waters 泵1515，示差检测器2414；检测器50℃。
2结果分析
　　2.1 气相—质谱联用仪（gc/ms ）结果及分析①正丁醇提取液分析（图1）。结果显示正丁醇提取液中含有4种化合物： a）出峰时间在36.02处有一个化合物：结构为：hexanedioic acid, bis（2-ethylhexyl） ester，分子量：370.31，分子式：c22h42o4。b)出峰时间在36.90处有一个化合物：结构为：n-hexadecanoic acid，分子量：256.24，分子式：c16h32o2。c)出峰时间在39.68处有一个化合物：结构为：1，3-cyclopentanedione，2，4-dimethyl-，分子量：126.07，分子式：c7h10o2。d)出峰时间在40.73处有一个化合物：结构为：1，2-dithiolane-3-pentanoic acid，分子量：206.04，分子式：c8h14o2s2。②石油醚提取液分析（图2）。结果显示石油醚提取液中含有1种化合物：tetradecanoic acid。分子量：228.21，分子式：c14h28o2。
　　2.2 高效液相结果及分析:（ 图均已积分）①正丁醇提取液分析（图3）。②石油醚提取液分析（图4）。③三氯甲烷提取液分析（图5）。④乙酸乙酯提取液分析（图6）。
　　2.3 液质联用仪结果分析①正丁醇提取液分析（图7、8）。分析结果有八个化合物存在，并占有一定含量。其中以6号化合物感应强度最大，且在一级质谱图中可以明显确定其分子量为565.6（ms m/s:566.6（m+）；588.6（m+na），见图9和图10）。和背景化合物比较,可以确定为新的化合物。其他化合物由于现有条件无法做出更深一步的判断，待以后深入研究。同时，实验中曾改变紫外波长为210进行比较分析，但是最后由于波长210下的色谱和质谱比较重合性较差，所以选择波长外280的实验结果。但波长210下的分析数据可供参考，为以后进一步研究做参考。见图11。②乙酸乙酯提取液分析（图12、13）。分析结果有四个比较明显的化合物存在，并占有一定含量。但化合物由于现有条件无法做出更深一步的判断，待以后深入研究。它们的质谱图如图14-17。
　　2.4 凝胶色谱结果及分析（图18-20）分析结果表明：水相中化合物有两大类，分子量大概在10，000左右和小于100的化合物存在，并占有相当大含量。但由于现有条件无法做出更深一步的判断，待以后深入研究。
　　以下为凝胶色谱的标准图如图21：
　　分子量分别为：277000、12900、1460、106。
　　3讨论与小结
　　本论文的研究工作主要取得以下结果：①以海绵为分离样品，采用多种分离技术分离得到多种化合物。结果表明，石油醚，三氯甲烷，正丁醇，乙酸乙酯分别能提取到有机化合物，而水相中也能得到化合物。②以气相—质谱联用仪分析技术分离得到hexanedioic acid、bis(2-ethylhexyl)ester、n-hexadecanoic acid、1,3-cyclopentanedione、2,4-dimethyl-，1,2-dithiolane-3-pentanoic acid5种化合物。③石油醚，三氯甲烷，正丁醇，乙酸乙酯提取液经高效液相技术分离共得到26种化合物。其中有些物质是重复的，说明很多化合物可能是同时溶于有机相或同时溶于其中某几项。同时也说明有些化合物的性能或结构是非常相似，在一定程度上比较难以分离，需改进技术或改变方法来进行深一步的研究试验。④以液质联用仪分离技术分离得到12个不同分子量的化合物。其中以分子量为565. 6（ms m/s:566.6（m+）；588.6（m+na））的化合物可以确定为新化合物，因为在色谱库和相关文献中都没提及过该分子量的化合物。以后的研究工作将以此化合物为重点进行研究，相信通过更深入的分析鉴定，能确定该化合物的结果和特征。⑤以凝胶色谱分析技术得到溶于水相中的化合物有两大类，分子量大约在10，000da左右和小于100da，两者都有相当高含量。根据现有条件，估计分子量小于100的化合物中可能有海绵中的一些小分子的酸和碱等化合物，当然也可能是实验的误差，使一些甘油未除尽，所以还有点甘油存在；而分子量在10，000左右的化合物很可能是一些不易溶于以上4种有机溶剂的高分子聚合物，当然也有可能是提纯过程中留下的极小部分的细胞碎片。⑥本研究利用该领域还未有人用气质联用仪，液质联用仪技术来互补分析海绵中的有机物成分，通过对有机相和无机相的分析，对海绵中的化合物分离提取是比较全面的。但是由于客观条件的限制，目前的研究结果中仍存在有未确定的化合物，例如水相中分子量在10，000左右的化合物和质谱中有显示而色谱中未能查到的化合物，及质谱中一些含量不高的小峰所代表的化合物作更深入的研究奠定了一定的基础。
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