摘要：该研究以中国石竹2个品种的雄性不育植株带芽茎段为初始外植体进行组织培养，筛选了适合其芽诱导、继代增殖的培养基配方，并对试管苗移栽介质进行了挑选，成功地建立了2个中国石竹雄性不育植株的离体繁殖与保存体系。结果表明：中国石竹芽的最佳诱导培养基为ms+6-ba 1.0 mg/l+naa 0.3 mg/l，最佳继代增殖培养基为ms+6-ba 0.3 mg/l+naa 0.1 mg/l，最适宜的试管苗移栽基质是珍珠岩。同时，2个不育材料组织培养繁殖后代仍表现为雄性不育，确保了原材料的雄性不育性状的稳定性。
关键词：中国石竹；6-ba；离体繁殖；雄性不育
中国石竹（dianthus chinensis）又称石竹、洛阳花，是石竹科石竹属的一种重要观赏花卉，可扦插、分株繁殖，在园林中多用于花坛、花境、花台或盆栽[1-2]。
植物雄性不育是植物在有性繁殖过程中不能产生正常可育雄配子体的遗传现象，广泛存在于开花植物中。雄性不育现象可分为细胞核质互作雄性不育和核雄性不育2种类型。此外，还包括主要由环境因子引起的形态不育和生理不育[3]。选育并保存石竹雄性不育系进行杂交制种，可免去人工去雄，节省大量的人力、物力，降低成本，并可提高杂交种子的纯度，增加产量，扩大杂种优势的利用范围，具有极大的商业价值[4]。
该试验采用2个中国石竹品种的雄性不育植株，通过茎段组织培养对其进行离体繁殖和保存，并对繁殖材料移栽后的育性进行观察，以期了解其不育性状的遗传稳定性，并建立起稳定有效的繁殖与保存体系，为中国石竹不育性状的后续研究和利用奠定基础。wWW.11665.Com
1材料与方法
1.1试验材料
供试植株为中国石竹紫红色和粉红色2个品种分离出的雄性不育植株，取自湖北省林木育种中心。
1.2试验方法
1.2.1材料的采集和消毒。从上述2种雄性不育植株上选取带芽茎段（芽尚未萌动）作为外植体，剥去叶片，用自来水冲洗干净后，在无菌环境下先用70％酒精消毒1 min，再用0.1％升汞溶液消毒8 min，无菌水冲洗4～5次，然后在无菌条件下进行接种。
1.2.2芽的诱导。将中国石竹的带芽茎段切成2～3 cm长，接种于诱导培养基中进行培养，培养温度25 ℃，光照时间14 h/d，光照强度2 000 lx（日光灯灯源），定期观察、记录其分化情况。
根据6-ba的浓度不同，培养基配方分为3种（表1）（琼脂浓度为7 g/l，蔗糖浓度为30 g/l，ph值6.0～6.5。培养基装瓶后在121 ℃、1.1 kg/cm2高压下灭菌20 min，下同）。每个品种每种培养基均做5个重复（玻璃瓶），每个重复接4个外植体。重复3次。
茎段的继代增殖。将培养15 d后分化出来的小苗切成带有1个以上腋芽的茎段，转接于继代增殖培养基中（表2），增殖4代，观察不同浓度的6-ba对其不定芽分化的影响，并从中筛选出适合中国石竹快繁的最适培养基。每个品种每种培养基均做5个重复（玻璃瓶），每个重复接4个外植体。重复3次。
1.2.4生根诱导。经过继代增殖的不定芽生长至3～4 cm高时，将粗壮的茎段切成具1～2个节的茎段，转接于生根培养基中，促进其生根。20 d后观察统计苗的生根情况。
1.2.5试管苗的移栽。生根诱导25 d后开瓶炼苗7 d，即可进行移栽。选取健壮的试管苗，洗净其根部附着的培养基，移栽到含营养土的营养钵中。移栽前基质采用高温灭菌，栽后浇透水放于人工控温箱中，保持湿润。培养14 d可将移栽苗从人工控温箱中取出，在自然条件下加强阳光照射14 d，随后移入花盆定植于室外大棚中，盆土选择通透性好的泥炭土。定植后应立即浇透水，观察记录成活株数。
1.2.6田间管理与育性观察。将试管苗定植于花盆中10 d左右，浇1次肥水。在其花期阶段，观察移栽苗的生长特性和开花后育性，并确定其不育性状的遗传稳定性。
1.3数据处理与统计
诱导率（%）＝对于百分数的数据，在进行方差分析之前将其转换成平方根的反正弦。试验数据通过sas软件进行方差分析和0.05水平下的lsd测验，以判断各处理间的差异显著性，从而筛选出各阶段最适宜的培养基或移栽基质。
2结果与分析
2.1芽的诱导
外植体培养7 d左右腋芽开始萌发，并且生长较快，2
0 d时对芽分化率和外植体平均出芽数进行记录，因无论使用哪种培养基，每个外植体的芽分化率均为100％，故只对外植体平均出芽数进行方差分析。由表3可知，6-ba浓度间的处理存在极其显著的差异，而品种间则无显著差异。
由表4可知，处理a1诱导出的不定芽较健壮，但数量较少；处理a2外植体平均出芽数最高，出芽快且苗生长健壮，基本无玻璃化现象产生；处理a3诱导出的苗容易发生玻璃化，从而减少了有效苗的数量。因此，6-ba在1.0 mg/l时是最适宜的浓度水平。
2.2茎段的继代增殖
由表5可知，6-ba浓度间的处理存在极其显著的差异，而品种间则无显著差异。
6-ba的浓度在0.1～0.5 mg/l的范围内均可以诱导腋芽萌动，但在不同浓度的6-ba的作用下，芽的生长状况差异很大。由表6可知，处理b1芽的增殖倍数最低，且容易产生玻璃化；处理b3芽的增殖倍数最高，分枝能力最强，但是其增殖产生的小苗生长细弱，且容易产生愈伤组织；处理b2小苗生长健壮，畸形化现象少，且处理b2、b3间无显著差异。故6-ba浓度为0.3 mg/l时，是最适合中国石竹快繁继代增殖的培养基[5]。
2.3试管苗的移栽
培养7 d左右茎段切口处开始膨大，渐渐出现浅黄色的瘤状突起（根原基），14 d后白色的根开始萌发伸长，25 d左右根可长至3.5～5.0 cm，呈辐射状，有须根。将生根后的试管苗移栽至栽培基质中培养。
移栽基质也是影响移栽成活率的重要因素之一[6]，尤其对草本植物的影响较大。在保持空气湿度的条件下，珍珠岩能给根系提供良好的通气条件，可以防止杂菌污染，且因中国石竹喜阳光、高燥、通风、凉爽环境，性耐寒，忌湿涝和黏土，故珍珠岩为中国石竹移栽最适宜的基质。
2.4育性观察
试管苗移栽生长20~30 d后上盆或定植，30 d左右即可开花。在开花期观察再生苗的花器官形态特征，发现其花色从初花期到盛花期由深变浅，所有花器官形态在花萼、花瓣方面与其他可育植株没有差异，而二叉雌蕊（少有3叉雌蕊）比可育植株的长、粗壮且张开角度大，从外观看完全无雄蕊；将花朵纵向切开后可以看到，雄蕊的花丝短缩在花冠筒内，无花药，或虽有花药但花药中无花粉粒，或者只有少数干瘪的花粉粒。由此可确定其全部为雄性不育植株，保持了原材料的不育性状。
3结论与讨论
3.16-ba对中国石竹茎段腋芽分化的影响
对大量植物的组织培养研究表明，细胞分裂素中应用最多的是6-ba，用量一般为1.0～2.0 mg/l最适宜。该试验表明，中国石竹其腋芽分化所需的6-ba的浓度较低，仅1.0 mg/l，而增殖只需要0.3 mg/l，且芽生长较健壮，增加6-ba的浓度反而会抑制芽的生长，甚至导致变态芽的发生[7]。
3.2中国石竹试管苗的玻璃化情况
该试验中经常会出现玻璃化的现象，是中国石竹组织培养中的一大障碍，这与培养基、培养条件均有关系[8]。据观察，继代转接时，每瓶接入的小苗过多，苗过分拥挤，试管苗容易玻璃化，此时小苗徒长，细弱瘦长，叶片和茎呈半透明状，下部叶片枯黄脱落，造成苗基部光秃。另外，超过1个月没有及时继代培养的小苗容易玻璃化。
前人的研究表明，导致玻璃化发生的因素很多，如无机盐类、碳水化合物、琼脂、生长调节剂、培养容器封口、光照、培养温度和湿度等因素，但影响不同植物的主导因素可能各不相同[8-9]。克服中国石竹玻璃化的措施还有待进一步研究。
3.3 材料雄性不育性状的遗传稳定性
在试验的继代增殖过程中，共继代了4次，相当于在原始材料的基础上繁殖了4代，而最后的试管苗仍为雄性不育的，说明雄性不育性状并未因繁衍次数的增多而发生变异，同时也未受到试验过程中植物生长调节剂（主要是6-ba、iba与naa）的影响，进一步确定了此性状的遗传稳定性。
通过对雄性不育和可育石竹材料的花器官形态比较，发现雌蕊也存在很大差别，其二叉雌蕊（少有3叉雌蕊）比可育植株的长、粗壮且张开角度大，这样可能有利于其接受外来花粉。这种形态的变化可能就是由于其雄蕊的败育引起的，它在开花期不能像可育植株那样接受自花授粉。因此，雌蕊就特化成能更利于接受外来花粉的形态，保证其繁衍后代的能力。
4参考文献
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[9] 黄莺，范燕萍，王文生，等.石竹愈伤组织诱导及植株再生[j].华南农业大学学报，2003，24（1）：50-52.
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