摘要针对麻痹性贝毒的检测技术,着重从生物学测试方法、化学测试分析方法2个方面概括地介绍了贝毒检测技术研究的进展。总结了几种相关检测技术各自的优点和不足及几种方法有机结合和优势互补,提出了技术的革新和新方法的使用将是贝类毒素检测手段的发展方向。
关键词麻痹性贝毒;分析方法;生物学测试法;化学测试法
advanceintheresearchmethodtodeterminediarrheticshellfishpoisons
shi chang-leizhou zhi-gangliu tongding jia-linyu yong-gang
(the fishery technology spread station of lvshun in dalian city of liaoning province,dalian liaoning 116041)
abstractin this paper,focusing on the detection of paralytic shellfish poisoning techniques,the biological testing methods,and chemical test analysis methods were described in general on shellfish poisoning detection technology progress. the advantages and disadvantages of several related detection techniques,and several ways to combine and complement each other were summarized. new technology and new methodology will be the direction for shellfish toxins.
key wordsparalytic shellfish poisoning toxins(psp);analytical method;biological method;chemicalmethod
随着社会的发展,人们的生活质量渐渐提高,各种海产贝类食品越来越多地进入了寻常百姓家的餐桌,并且越来越受到欢迎。WWW.11665.COM然而人们在享受美味的同时,却不知道有些贝类是有毒的,使近年来贝类中毒事件频繁发生[1-3]。海洋中的贝类有扇贝、蛤蜊、贻贝等,它们均以生活在海水中的单细胞藻类为食物。但有些单细胞藻类是有毒的[4],当贝类摄食了大量有毒藻类时,毒素就会在贝类体内累积,使贝类具有毒素,这种毒素称为贝毒。贝类中的毒素以麻痹性贝毒与腹泻性贝毒的危害最严重,加热和冷却均不能将其破坏[5]。而麻痹性贝毒是剧毒性化合物,对生物神经系统或心血管系统有高度特异毒性。世界各国对其进行了大量的研究和分析[5-6],为此笔者对国内外麻痹性贝毒中常见的分析方法进行综述,为研究麻痹性贝毒提供理论帮助。
1生物学测试方法
1.1小鼠生物测试法
小鼠生物测试法是最为常见的一种测试海洋生物毒素的方法。主要是因为小鼠是一种啮齿哺乳类动物,繁殖很快,容易饲养。目前,小鼠腹腔注射检测psp毒素的方法成为美国分析化学协会(assoeiation offial analytical chemists,aoac)的标准方法[7]。由于psp毒素在ph值3~4时最稳定[8];提取物中大量的盐,主要是na+会降低生物测试的毒性值[9],因此在试验中要严格控制毒素提取溶液的ph值和盐的含量。牡蛎样品中积累的锌元素也会对小鼠有致死作用,导致测试分析结果偏高[10]。同时由于不同品系的小白鼠对psp的敏感性差异较大,故标准方法中选用icr品系小鼠为测试动物,以15 min内将1只体重为20 g的icr品系的雄性小鼠杀死的毒性定义为1鼠单位(mu),1mu=0.18 pgstx。
1.2其他生物体内测试法
家蝇生物测试法分析psp:将psp的酸性提取液注入家蝇的体内,观察家蝇的活动特征,并记录死亡时间。分析方法与小鼠生物测试很相近。用该方法检测贝样中psp的最低限为20 pgstxeq/100 g贝组织[11]。但由于该方法需要借助显微镜注射样品,操作困难,没有被推广使用。
蝗虫生物测试法分析psp:沿蝗虫的腹部在体节之间注射 10 μl的测试样品,观察并记录一定时间内被麻痹蝗虫的百分率。结果发现,该方法与小鼠生物测试和液相色谱等分析结果基本一致[12]。
1.3细胞毒性测试法
细胞毒性测试法也叫组织培养分析法,该方法测试psp毒素的原理是箭毒、藜芦定对神经母细胞瘤na+通道具有协同的开放作用,可增进na+向细胞内的流动,从而引起细胞内外渗透压的改变,使细胞形态肿胀甚至导致细胞裂解死亡。作为na+通道阻断剂的psp毒素可拮抗这种细胞肿胀作用,并且拮抗程度与毒素的剂量具有很好的相关性。jellett等[13]应用这一原理建立了测试psp的方法,主要步骤是将分离的小脑神经细胞悬浮于一定的培养基中,该细胞一旦在培养基中分化,能够表达对psp敏感的电压依赖式na+通道。用一定浓度的藜芦定处理,向培养基中分别加入不同浓度的psp提取液或不同稀释度的标准毒素,24 h后用二乙酸荧光素和嗅化乙锭等荧光剂处理细胞。在荧光灯下,存活的神经细胞呈现绿色,而死亡细胞的核呈现红色。根据存活细胞占总细胞的百分率计算测试样品中的毒素含量。该方法的最低检出限约为40 μgstx/100 g组织。目前,由jellett biotek ltd. 公司建立的用于psp检测的神经细胞生物分析装(mist tm),市场上已有销售,并且使用该装置测试贝类中的psp得到了很好的结果。该装置的最低检出限为2 μgstxeq/100 g贝肉,灵敏度远远高于小鼠生物测试法。但由于其组织培养期较长,成本相对较高,没有得到普遍推广。
1.4免疫测试分析法
目前,利用免疫测试分析法检测stx毒素的试剂盒(ri dascreenr-biopharm,darmstad,germany)已经上市,但还未经美国分析化学家协会(aoac)确认为标准测试方法。其主要缺点是其他psp毒素之间的交叉反应难以避免。由jellet biotek ltd.公司开发的基于侧向流免疫色谱分析psp毒素的mist试剂盒,能够在20 min内完成定盆分析,可以作为排除阴性样品的预扫描手段[14]。只需要比较测试色带上2条线的颜色即可,和ph试纸的使用一样简便。每一种psp毒素类型在管理标准附近都能够检测。但由于不同种psp毒素对抗体混合物的亲和力有较大的差异,不同毒素组成的样品测量结果波动较大,也难以对样品进行准确定量。
1.5放射受体分析法
对于psp毒素的分析,人们建立了放射受体分析法[15],其主要原理是:取大鼠大脑细胞膜上的na+通道受体固定在微滴板表面,通过待测样品和氛标记的标准stx(3h-stx)与受体的竞争性结合,来测定样品中psp毒素的毒性。该方法对psp毒素的敏感性极高,检出限达4 ngstxeq/min。
2化学测试方法
2.1电泳技术测试法
2.1.1平板电泳法。对于psp毒素的检测,人们使用凝胶和纸电泳技术建立了多种分离检测方法[16]。该方法通常使用过氧化氢显色,用紫外灯检测,能够快速检测一些样品,但其对样品是无法定量的。后来有人使用扫描荧光检测器进行检测,提高了这种方法的灵敏度[17]。
2.1.2毛细管电泳法。毛细管电泳(capillary electrophoresis,ce)是一种相对较新的技术,在生物毒素的分析方面将会有很广泛的应用。总的来讲,该方法是使用很细的熔硅材质的毛细管(id约为100 μm)代替了电泳凝胶,在测试前向毛细管中加入几纳升的样品,给毛细管加高电压后样品就会沿着毛细管迁移,在迁移过程中不同组分的毒素达到分离的效果,再经过荧光或紫外检测池进行检测。这一技术拓宽了分析对象的应用范围,甚至对没有净电荷的物质也可以进行检测。
wright等[18]利用ce系统和荧光检测器建立了分析stx毒素的方法,检测限达1 pg/kg。但该系统需要对stx毒素衍生后再进行检测,设备也非常昂贵。thibault利用ce系统和紫外检测器建立了分析neostx和stx毒素的方法,但其检出限太高,目前只能用于对天然产物的初扫描。
2.2色谱技术测试法
2.2.1薄层色谱法。薄层色谱法(thinlayer chromatography,tlc)是将固定相涂布在平板(玻璃板、铝箔等)上,点样后用合适的流动相进行洗脱,不同组分的毒素将在平板上分离开。目前,该方法已广泛用于食品分析领域。在检测psp毒素时,一般使用硅胶作固定相,用丁醇—醋酸—水或者嗜咤—乙酸乙酯—醋酸—水等溶剂系统作为流动相。显色时使用h2o2、koh、wabre试剂、fast blueb试剂等作为氧化剂。shoptaugh等[19]发现h2o2和koh可使stx和gtx2o产生荧光,便于检测。
2.2.2液相色谱法。液相色谱法(liquid chromatography,lc)在海洋生物毒素的化学检测方法中占主导地位。该方法在20世纪90年代成为psp分析技术研究领域的热点。在过去的10余年中人们建立了lc分析psp毒素的常规方法,并逐步完善。1988年,sullivan[20]使用离子交换色谱和柱后衍生建立了分析psp的方法,可分析12种氨甲酞基和磺化氨甲酞基psp毒素。但该方法对stx和dcstx毒素的分辨率很低[21],未得到推广。thibault等使用离子对试剂和切换洗脱液的方法可以提高脱氨甲酞基毒素的分辨率。由于柱后衍生系统的使用带来了峰扩展的问题,为此有人提出使用柱前衍生的方法[22],但不能够分辨psp毒素中的某些手性异构体。oshima [23]使用三次等梯度洗脱和柱后衍生的方法能够分析绝大多数的psp毒素。由于psp毒素缺少发色基团,并且不同的毒素在不同衍生条件下获得产物的比率不同,不同产物的荧光信号强度也有较大的差别,因此在分析时需要有标准毒素才可以进行定性和定量分析。对c毒素的分析,一般采用水解的方法进行间接分析。
2.2.3色谱联用技术。色谱联用是指通过一个合适的方式,将用于定性分析的质谱联接成为色谱分离后的检测器,可充分发挥色谱的分离优势和质谱的定性优势,达到对样品很好地定性和定量分析的目的。液质联用依赖于高效液相色谱把psp成分通过界面装置带到质谱中。有2种界面技术可用,一种是电喷雾电离(esi),另一种是大气压化学电离(ap-cl),这2种技术目前都已经应用于psp分析。
eike等[24]采用高效离子交换色谱,样品柱后电化学氧化,平行使用荧光和ms检测器分析psp毒素,检测限为0.8 μg/g。该方法的优点是使用nh4cooch3水溶液作为流动相进行阴阳离子交换联合层析,这种流动相能够进行在线lc-ms分析,并且能够在一次进样层析中分离stx、gtxs、neostx、dcstx等麻痹性贝毒,省去了aoac传统色谱分析方法中繁琐的毒素分离前处理过程。eike还对此方法做了改进,使用ce(毛细管电泳)代替荧光检测器,采用lc-ms联用技术,分析麻痹性贝毒,结果比只使用带荧光检测器的lc高一个数量级。
3结语
近年来,由于工业废水、生活污水等大量排入,造成海水富营养化,导致赤潮频发。赤潮中藻类大量繁殖,对贝类养殖业造成严重的经济损失,更是危害人类健康,有关psp的中毒事件屡见不鲜,而我国开展psp方面的研究还不够深入,麻痹性贝毒在双壳贝类体内的动力学研究起步比较晚,仅涉及psp毒素在贝体内的累积、排除和转化规律等有关问题[25]。psp毒素作为海洋生物活性物质药物的研究,也少有文章报道。
海产贝类作为我国主要出口创汇产品之一,还未形成配套的卫生质量标准及监测监控体制。由于无法提供养殖海域贝毒监测资料,自1997年欧盟对我国的养殖贝类产品禁止进口以来,到目前为止欧洲市场一直未对我国开放。为了维护和发展我国贝类养殖业,确保海产品的食用安全和促进海产品的出口贸易等,我国应在以下几个方面加强研究:一是加强保护近岸海域养殖生态环境;二是研制快速检测psp使用的试剂盒;三是psp毒素标准品的制备;四是寻找psp中毒的治疗解药;五是制定我国psp的监测方案和水产品的happc体系。
4参考文献
[1] 邱德金,林永水,周近明,等.利玛原甲藻腹泻性毒素的生物学测定[j].热带海洋,1996(4):46-49.
[2] 迟玉森,胡德亮,赵光莉.扇贝毒素及扇贝食用的安全性[j].食品科学,1997(12):45-46.
[3] 梁松,钱宏林.加强贝毒管理工作的探讨[j].海洋通报,1993,12(2):83-88.
[4] 田口滋之.东北沿岸域における贝毒问题[j].沿岸海洋研究,1994,32(1):55-67.
[5] 野口玉雄. 麻ひ性贝毒[j].海洋科学,1984,16(10):587-594.
[6] 林燕棠,杨美兰,陈瑞雯,等.广东沿海麻痹性贝类毒素的研究[j].海洋与湖沼,1994,25(2):220-225.
[7] hollingworth t,wekell m m.fish and other marine products 959.08.paralytic shellfish poisoning.biological method,final action[m]∥hellrich l k.oficial methods of analysis of the assoeiation of ofici-alan alyticalch emists(15th edition),1990:881-882.
[8] 许敏,赵以军,程凯.水华和赤潮的毒素及其检测与分析[j].湖泊科学,2001,13(4):376 对于psp毒素的分析,人们建立了放射受体分析法[15],其主要原理是:取大鼠大脑细胞膜上的na+通道受体固定在微滴板表面,通过待测样品和氛标记的标准stx(3h-stx)与受体的竞争性结合,来测定样品中psp毒素的毒性。该方法对psp毒素的敏感性极高,检出限达4 ngstxeq/min。
2化学测试方法
2.1电泳技术测试法
2.1.1平板电泳法。对于psp毒素的检测,人们使用凝胶和纸电泳技术建立了多种分离检测方法[16]。该方法通常使用过氧化氢显色,用紫外灯检测,能够快速检测一些样品,但其对样品是无法定量的。后来有人使用扫描荧光检测器进行检测,提高了这种方法的灵敏度[17]。
2.1.2毛细管电泳法。毛细管电泳(capillary electrophoresis,ce)是一种相对较新的技术,在生物毒素的分析方面将会有很广泛的应用。总的来讲,该方法是使用很细的熔硅材质的毛细管(id约为100 μm)代替了电泳凝胶,在测试前向毛细管中加入几纳升的样品,给毛细管加高电压后样品就会沿着毛细管迁移,在迁移过程中不同组分的毒素达到分离的效果,再经过荧光或紫外检测池进行检测。这一技术拓宽了分析对象的应用范围,甚至对没有净电荷的物质也可以进行检测。
wright等[18]利用ce系统和荧光检测器建立了分析stx毒素的方法,检测限达1 pg/kg。但该系统需要对stx毒素衍生后再进行检测,设备也非常昂贵。thibault利用ce系统和紫外检测器建立了分析neostx和stx毒素的方法,但其检出限太高,目前只能用于对天然产物的初扫描。
2.2色谱技术测试法
2.2.1薄层色谱法。薄层色谱法(thinlayer chromatography,tlc)是将固定相涂布在平板(玻璃板、铝箔等)上,点样后用合适的流动相进行洗脱,不同组分的毒素将在平板上分离开。目前,该方法已广泛用于食品分析领域。在检测psp毒素时,一般使用硅胶作固定相,用丁醇—醋酸—水或者嗜咤—乙酸乙酯—醋酸—水等溶剂系统作为流动相。显色时使用h2o2、koh、wabre试剂、fast blueb试剂等作为氧化剂。shoptaugh等[19]发现h2o2和koh可使stx和gtx2o产生荧光,便于检测。
2.2.2液相色谱法。液相色谱法(liquid chromatography,lc)在海洋生物毒素的化学检测方法中占主导地位。该方法在20世纪90年代成为psp分析技术研究领域的热点。在过去的10余年中人们建立了lc分析psp毒素的常规方法,并逐步完善。1988年,sullivan[20]使用离子交换色谱和柱后衍生建立了分析psp的方法,可分析12种氨甲酞基和磺化氨甲酞基psp毒素。但该方法对stx和dcstx毒素的分辨率很低[21],未得到推广。thibault等使用离子对试剂和切换洗脱液的方法可以提高脱氨甲酞基毒素的分辨率。由于柱后衍生系统的使用带来了峰扩展的问题,为此有人提出使用柱前衍生的方法[22],但不能够分辨psp毒素中的某些手性异构体。oshima [23]使用三次等梯度洗脱和柱后衍生的方法能够分析绝大多数的psp毒素。由于psp毒素缺少发色基团,并且不同的毒素在不同衍生条件下获得产物的比率不同,不同产物的荧光信号强度也有较大的差别,因此在分析时需要有标准毒素才可以进行定性和定量分析。对c毒素的分析,一般采用水解的方法进行间接分析。
2.2.3色谱联用技术。色谱联用是指通过一个合适的方式,将用于定性分析的质谱联接成为色谱分离后的检测器,可充分发挥色谱的分离优势和质谱的定性优势,达到对样品很好地定性和定量分析的目的。液质联用依赖于高效液相色谱把psp成分通过界面装置带到质谱中。有2种界面技术可用,一种是电喷雾电离(esi),另一种是大气压化学电离(ap-cl),这2种技术目前都已经应用于psp分析。
eike等[24]采用高效离子交换色谱,样品柱后电化学氧化,平行使用荧光和ms检测器分析psp毒素,检测限为0.8 μg/g。该方法的优点是使用nh4cooch3水溶液作为流动相进行阴阳离子交换联合层析,这种流动相能够进行在线lc-ms分析,并且能够在一次进样层析中分离stx、gtxs、neostx、dcstx等麻痹性贝毒,省去了aoac传统色谱分析方法中繁琐的毒素分离前处理过程。eike还对此方法做了改进,使用ce(毛细管电泳)代替荧光检测器,采用lc-ms联用技术,分析麻痹性贝毒,结果比只使用带荧光检测器的lc高一个数量级。
3结语
近年来,由于工业废水、生活污水等大量排入,造成海水富营养化,导致赤潮频发。赤潮中藻类大量繁殖,对贝类养殖业造成严重的经济损失,更是危害人类健康,有关psp的中毒事件屡见不鲜,而我国开展psp方面的研究还不够深入,麻痹性贝毒在双壳贝类体内的动力学研究起步比较晚,仅涉及psp毒素在贝体内的累积、排除和转化规律等有关问题[25]。psp毒素作为海洋生物活性物质药物的研究,也少有文章报道。
海产贝类作为我国主要出口创汇产品之一,还未形成配套的卫生质量标准及监测监控体制。由于无法提供养殖海域贝毒监测资料,自1997年欧盟对我国的养殖贝类产品禁止进口以来,到目前为止欧洲市场一直未对我国开放。为了维护和发展我国贝类养殖业,确保海产品的食用安全和促进海产品的出口贸易等,我国应在以下几个方面加强研究:一是加强保护近岸海域养殖生态环境;二是研制快速检测psp使用的试剂盒;三是psp毒素标准品的制备;四是寻找psp中毒的治疗解药;五是制定我国psp的监测方案和水产品的happc体系。
4参考文献
[1] 邱德金,林永水,周近明,等.利玛原甲藻腹泻性毒素的生物学测定[j].热带海洋,1996(4):46-49.
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[8] 许敏,赵以军,程凯.水华和赤潮的毒素及其检测与分析[j].湖泊科学,2001,13(4):376-384.
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