摘要从外植体种类、无菌体系的建立、培养基及激素选择、生根方法等方面综述了珙桐组织培养研究进展,并对今后工作进行了展望。
关键词珙桐;组织培养;研究进展;外值体;无菌体系
abstract research advances on tissue culture of davidia involucrata were reviewed,including the types of explants,the establishment of asepsis tissue culture system,selections of medium and hormone,rooting method,etc. the prospective study on tissue culture of davidia involucrata was proposed.
key wordsdavidia involucrata;tissue culture;research advances;explants;asepsis system
珙桐(davidia involucrate baill)为珙桐科单型属植物,其天然分布仅在湖北、四川、贵州、湖南、陕西、云南、甘肃等省,且分布不均[1],数量极少,于1999年被列为国家ⅰ级重点保护野生植物。它树形高大,树干粗直,具有很高的观赏价值,是世界著名的观赏树种[2]。此外,其木材纹理好,可以用于雕刻及精致家具的制备,种子果皮可用于榨油[3],因此人们已肯定珙桐在园林绿化、生态学及植物资源学方面的价值。wwW.11665.com在自然条件下,珙桐以种子进行繁殖[4],外果皮坚硬,不利于透气透水,中果皮、内果皮和胚乳中存在抑制物[5],二度休眠、种子败育[6]导致了其种子萌发率极低。采用激素浸泡处理种子可以大大提高种子的萌发率,但在幼苗期死亡率高[7]。从现有的研究报道来看,珙桐的快繁、再生体系的建立尚处于起步阶段,且进展缓慢,多数研究集中在愈伤组织的获得方面,只有极少数成功获得了分化苗,但分化率较低,尚不能满足工厂化生产的要求。
1外植体种类
植物体上切取下来进行培养的那部分组织或器官叫做外植体[8]。珙桐组培中所用的外植体有以下几种。
1.1冬芽
冬芽是珙桐组培中使用频率最高的外植体。早在1982年,毕世荣等采用冬芽,经过愈伤诱导,分别形成了根、芽和小苗,虽然对激素的最适浓度、增殖倍数等未作明确说明,但为后人的科研工作奠定了基础。后来的多数研究仅处于初代培养阶段,仅成功地诱导出愈伤组织或得到较高的芽萌动诱导率[9-12],但没有由愈伤诱导或直接分化形成再生苗。金晓玲等[13]采用冬芽,不经过愈伤诱导,以形成丛生芽的方式,初步解决了珙桐分化的问题,成功获得了完整的植株,并且移栽成活。但其分化率过低,且在培养中褐化问题严重,严重影响了分化率。
1.2种子
但由于珙桐种子的结构及生理后熟等的特点,给珙桐种子的组培带来了很大的阻碍。董社琴等[14]采用低温培养种胚的办法,证明了6-ba能解除珙桐种子萌发的抑制作用,ga3对解除种子生理后熟有重要作用,iaa对解除种子形态后熟有作用,它与ga3在种子体内起着协同作用,虽然没有获得完整的植株,但对珙桐种胚的组培工作起了重要的铺垫作用。李月琴等[15]采用低温浸泡种子、常温培养,经过愈伤组织的诱导,获得了完整的植株,但增殖系数很低,尚不能达到快繁的目的,且没有解决褐化的问题。这也说明不同的处理方法对种胚的培养具有显著的影响,需进一步研究低温浸泡的时间及培养温度,并且完善种胚的培养方法。
1.3根、茎、叶
采用根为外植体的较少,且采取根对珙桐有破环作用,对于濒危植物来说更是不可取的方法。董社琴等[16]采用一至二年生珙桐的根尖为外植体,愈伤组织的诱导率高达98.83%,经过诱导后可以形成不定芽和不定根。罗世家[17-18]以茎、叶、芽为外植体,采用正交设计的方法研究了不同培养基、激素配比对愈伤诱导的影响,证明了不同的外植体其最适的培养基也不同,芽相对于茎和叶较容易诱导出愈伤组织。
以冬芽、种子、根、茎、叶为外植体,均成功地诱导出愈伤组织或取得较高的冬芽诱导率,但只有少数成功地获得了分化苗,但分化率、增殖系数过低,远远不能满足科研和工厂化生产的需要,在以后的研究中,应尝试采用新的外植体,扩大研究范围,找到最合适的培养温度、光照等培养条件。
2无菌体系的建立
消毒剂要尽量杀死外植体上所带的一切微生物,且不能损伤材料,较好地保持外植体的生活力。常用的消毒剂有乙醇、次氯酸钙、次氯酸钠、氯化汞、过氧化氢、抗生素等,消毒效果最好的是氯化汞。但对于不同外植体,采用的消毒剂的种类及处理时间差别很大,试验中要选择污染率较低且成活率高的杀毒剂。珙桐芽的消毒相对容易,而种子难于消毒,这与种子的结构密切相关。珙桐种子外果皮坚硬、不透水、不透气,消毒剂很难浸入,而取出种胚后进行消毒易导致种胚死亡。在研究中使用较多的是升汞,浓度为0.01%～0.10%,其次是次氯酸钠、次氯酸钙,浓度可达10%。采用升汞处理种胚消毒效果较好,但对环境和人体伤害较大。应摸索出最适的消毒方法,以保证较低的污染率和死亡率,节约外植体材料。
3培养基及激素选择
培养基不仅为植物提供营养,而且培养基中的铁元素对胚的形成、芽的分化有显著促进作用,v■可促进愈伤组织的产生,v■能促进根的生长[15]。但在实验室的条件下不同物种以及同一物种不同部位之间最适的培养基不同。除刚建立无菌体系外,一般要加入植物生长调节剂来调节组织的生长和形态,常用的是分裂素和生长素,前者促进不定芽的发生,后者促进不定根的发生,当分裂素与生长素比例为某个水平时,外植体仅形成愈伤组织而不进行器官的分化[19]。珙桐冬芽诱导萌发阶段,低盐培养基wpm优于中盐培养基h和高盐培养基n6、ms。冬芽诱导愈伤阶段存在2种观点,一种认为低盐培养基1/2 ms优于中盐培养基h,另一种认为高盐培养基n6优于低盐培养基b5。目前低盐培养基wpm和1/2 s的使用,均获得了分化苗。细胞分裂素使用较多的为6-ba,在一定范围内高浓度的6-ba有利于芽的诱导及分化,但浓度过高则抑制诱导及分化,加入低浓度的naa有利于芽的诱导及分化。增殖及诱导阶段6-ba结合ga3使用取得了较好的结果。适宜的培养基与激素配比是建立珙桐快繁体系的关键,而珙桐濒危的特点决定了常规组培方法不能实现其快繁的目的,应尝试改良基本培养基,根据试验中的问题和目的重新配比铵态氮、硝态氮的比例及v■、v■及各种重要元素的比重。应尝试使用促进细胞分裂作用较明显的tdz等及多种细胞分裂素的综合使用。
4生根方法
增殖的目的是为了获得大量的无菌苗,然而这只是快速繁殖和保种的过程,只有经过根培养,形成具有根、茎及叶的完整的植株,才能满足生产和引种的需要。早在20世纪末毕世荣等将冬芽启动培养后直接放在附加10～15mg/l iba和将冬芽形成的愈伤组织附加2～5mg/l iba+1～2mg/l ba的培养基上,2个月均长出根,形成完整的小苗。金晓玲等[13]将茎长2～3cm的丛生芽接于wpm培养基中进行生根培养,30～40d后形成根系,研究发现naa效果要好于iba。
5展望
濒危植物珙桐的组织培养是解决珙桐种苗来源、扩大种植面积的重要的途径。虽然用成熟胚和冬芽作为外植体成功获得了珙桐的组培苗的报道,但分化率低,且褐化、变异严重,多数研究尚处于起步阶段,仍处于试验阶段而没有进行工业化生产。应进一步扩大外植体的选择范围,比较不同外植体诱导的差异,找出适宜的培养基种类、最佳的激素种类与配比以及适宜无机盐浓度、光照强度和温度是建立珙桐快速繁殖体系的关键。同时,应利用珙桐其他相关方向的研究成果,结合生物技术方法改良珙桐的品质,以用于珙桐的苗木生产。
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