大鼠肝细胞与kupffer细胞共同培养对两者功能和形态影响
【关键词】 肝细胞;枯否细胞;共同培养技术;清蛋白类;细胞因子类;大鼠
【摘要】 目的 观察大鼠肝实质细胞与kupffer细胞体外共同培养时对两者生长、形态及功能的影响。方法采用原位二步ⅳ型胶原灌注法、percoll液密度梯度离心法分离wistar大鼠肝实质细胞与kupffer细胞;体外将肝实质细胞与kupffer细胞按6∶1比例共同培养。观察不同情况下肝细胞生存时间和形态，每隔24 h检测培养上清液中清蛋白和谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)的水平，并在培养36 h用放免法检测上清液中白细胞介素1(il1)、白细胞介素6(il6)、肿瘤坏死因子α (tnfα)含量。结果 单独培养组肝细胞的生长、增殖迅速，并向正常肝细胞的形态演变，肝细胞可培养存活至15 d;共同培养组肝细胞生长增殖缓慢，细胞可培养存活至10 d。共同培养组上清液中清蛋白水平在24、36、48、60 h比单独培养组低(t=2.551～ 3.139，p<0.05);alt、ast水平在24、36、48、60 h比单独培养组高(t=2.446～3.108，p<0.05);共同培养组kupffer细胞保持il1、il6、tnfα分泌功能，而单独培养组未检测到il1、il6、tnfα。结论 大鼠kupffer细胞和肝实质细胞在适宜的培养条件下可进行共同培养，二者可以保持良好的分泌功能，可用于实验研究。WWw.11665.COm
【关键词】 肝细胞;枯否细胞;共同培养技术;清蛋白类;细胞因子类;大鼠
the effect of coculture in vitro of kupffer cells with hepatocytes on morphology and function of hepatocytes in rats kou chenguang, cao chengbo, yan xiaowen, et al (department of general surgery, the affiliated hospital of qingdao university medical college, qingdao 266003, china); [abstract] objective to observe the growth, morphology, and function of hepatocytes when cultured in vitro with kupffer cells in rats. methods insitu ⅳcollagenase twostep perfusion method and low speed gradient centrifugtion by percoll fluid were used to isolate parenchymal hepatic cells (phc) and kupffer cells in wistar rat, respectively. cocultivation of phc and kupffer cells was done in vitro according to 6∶1 ratio. the live time and form of the cells under different circumstances were observed. alt and ast levels in culture supernatant were detected at 24hourinterval, and the concentration of il1, il6 and tnfα measured by radioimmunoassay at 36 hours. results in solitaryculture group, the hepatocytes grew quickly and developed to the form of normal liver cells, which could survive 15 days; for those in coculture group, the cells grew and generated slowly, which survived 10 days. the levels of albumen in supernate of coculture group, at 24 h, 36 h, 48 h and 60 h, were lower than that in solitaryculture group (t=2.551-3.139,p<0.05), and that of alt and ast, at the same time points as above, were higher (t=2.446-3.108,p<0.05). in coculture group, the secretory function of il1, il6, and tnfα was retained, and in solitaryculture group, no il1, il6, and tnfα were detected. conclusion hepatocytes and kupffer cells of rat can be cultured together under a suitable condition, and the favourable secretory function of the cells be maintained for empirical study.
[key words] hepatocyte; kupffer cell; coculture technique;albumins; cytokines; rats
肝细胞分离、培养是研究肝脏和肝细胞的良好方法。尽管肝细胞在体内拥有相当强的增殖能力，但要肝细胞在体外保持分化状态且能继续增殖却非常困难。要明确影响肝细胞生长、分化和死亡的因素等，仍然面临认识水平和技术的挑战。实验已证实，肝实质细胞与非肝实质细胞或非肝细胞的共同培养可有效延长肝细胞的生存时间，促进肝细胞增殖;有助于保持细胞间特有的胆管结构，促进形成缝隙连接;可促进肝细胞的合成和分泌功能;有助于肝细胞维持其解毒功能[14]。目前进行的共同培养主要有肝细胞非肝细胞培养或肝实质细胞非实质细胞培养，而对肝细胞与kupffer细胞的共同培养的报道还较少。本实验在体外将肝实质细胞与kupffer细胞共同培养，观察体外联合培养体系中肝细胞形态、生长情况、功能的变化以及kupffer细胞细胞因子分泌情况,旨在为肝细胞在病毒学、免疫学、药理学及肝细胞移植等方面的研究提供良好的平台。
1 材料与方法
1.1 材料
雄性wistar大鼠6只，体质量180～200 g，spf级，由青岛市药物检验所实验动物中心提供。rpmi1640完全培养基购于中国医学科学院生物医学工程研究所;ⅳ型胶原酶、2.5 g/l胰酶、锥虫蓝均购于美国sigma公司;percoll液购自于北京华美公司;考马斯亮蓝g250、谷丙转氨酶(alt)试剂盒、谷草转氨酶(ast)试剂盒均由杭州博日生物技术有限公司提供;125i肿瘤坏死因子α(tnfα)放射免疫分析试剂盒、125i白细胞介素1(il1)放射免疫分析试剂盒、125i白细胞介素6(il6)放射免疫分析试剂盒均购自北京普尔伟业生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 肝细胞及kupffer细胞的分离 本文参照smedsrod等[5]方法加以改良分离收集肝细胞，利用percoll液密度梯度离心法收集kupffer细胞。
1.2.2 肝细胞和kupffer细胞的培养及观察 单独培养组调整肝细胞密度至1.5×108/l并接种到培养皿，置于含体积分数0.05 co2孵箱，在37 ℃、100%湿度条件下培养，12 h后更换新鲜培养液。共同培养组将肝细胞按1.5×108/l的细胞密度、kupffer细胞按2.5×107/l细胞密度(6∶1) 共同接种于培养皿，置于含体积分数0.05 co2孵箱，在37 ℃、100%湿度条件下培养，12 h后更换新鲜培养液。每培养12 h更换培养液并吸取上清液用全自动生化检测仪检测清蛋白、alt、ast、il1、il6、tnfα，并观察细胞形态及生长情况。
1.2.3 检测指标 采用考马斯亮蓝g250方法测定清蛋白，采用elisa法分别检测上清液中alt、ast、il1、il6及tnfα含量。
1.3 统计学处理
采用ppms 1.5软件[6]进行统计学处理，数据以±s表示，组间比较用两样本均数t检验。
2 结 果
2.1 形态学观察
倒置显微镜下，新分离的大鼠肝细胞晶莹透亮，呈圆球形，折光性强，有立体感。台盼蓝染色计数显示健康肝细胞的比例平均为92%。同时，新分离的kupffer细胞胞浆透亮，多呈圆球形，少数呈多形性，散在分布，大小不一致，约6 h后，细胞开始伸展，体积增大，48 h后细胞充分展开，呈典型的星形或多边形，边界不清。在单独培养组，肝细胞的生长、增殖较共同培养组的细胞迅速，接种4 h后肝细胞贴壁、伸展，连接成条索状;24 h后绝大多数肝细胞贴壁，呈扁平状，体积明显增大;48 h后肝细胞贴壁牢固，细胞开始增殖，细胞间出现岛状连接，部分肝细胞呈双核;72 h后肝细胞开始增殖，在原来肝细胞周围出现透明且体积较小的上皮样细胞，呈多边形，逐渐铺满培养皿底;10 d后培养液的上清中悬浮细胞逐渐增多，细胞开始大量死亡;至培养15 d时细胞全部死亡。在共同培养组，24 h后绝大多数肝细胞贴壁，呈扁平状，体积增大;肝细胞生长增殖缓慢，于96 h即开始出现少量的死亡细胞漂浮，至培养10 d时细胞基本全部死亡。
2.2 功能测定
共同培养组清蛋白水平在24、36、48、60 h低于于单独培养组(t=2.551～3.139，p<0.05);共同培养组alt、ast水平在24、36、48、60 h明显高于单独培养组(t=2.446～3.108，p<0.05);培养36 h后，共同培养组上清液中il1为(0.17±0.03)μg/l，il6为(0.03±0.01)μg/l，tnfα为(39.73±5.26)pmol/l，而单独培养组未检测到上述细胞因子。见表1～3。
表1 各组大鼠肝细胞上清中清蛋白水平比较(ρ/g·l-1，±s)组 别n24 h36 h48 h60 h单独培养组60.679±0.0450.556±0.0300.535±0.0440.536±0.044共同培养组6 0.548±0.059* 0.472±0.057* 0.468±0.047* 0.477±0.033* 与单独培养组比较,*t=2.551～3.139，p<0.05。
表2 各组大鼠肝细胞上清中alt水平比较(z/u·l-1，±s)组 别n24 h36 h48 h60 h单独培养组682.40±4.1882.90±2.6080.90±4.1682.80±2.92 共同培养组6 89.90±3.69* 86.90±2.62* 87.20±3.50* 89.80±4.65* 与单独培养组比较,*t=2.666～3.108，p<0.05。
表3 各组大鼠肝细胞上清中ast水平比较(z/u·l-1，±s)组 别n24 h36 h48 h60 h单独培养组6142.20±5.54140.50±6.44150.60±4.42149.50±3.94共同培养组6 151.20±5.57* 148.90±5.33* 160.80±6.78* 155.60±3.24* 与单独培养组比较,*t=2.446～3.090，p<0.05。
3 讨 论
3.1 肝细胞的分离及形态功能观察
肝细胞是肝脏最主要的实质细胞类型，正常生理状况下占60%。肝细胞完成肝脏的绝大部分功能，是肝脏的主要效应细胞，同时也是生物及化学损伤的主要靶点。肝细胞性状的生物学检测，包括形态和功能两方面。研究发现，细胞接种2 h后就开始贴壁，20 h后约有80%的细胞贴壁，细胞贴壁后开始变平变薄，可见双核细胞和多核细胞，部分细胞开始小范围的呈岛状连接;48 h变化更明显，整个细胞变薄并向四周拉平，细胞形成岛状连接成片，可见许多双核细胞和多核细胞;培养1周后可见少量的新生细胞，透亮，胞浆与胞核的区别不很明显;培养2周后，可见大量的新生细胞，也呈岛状生长，极具立体感[78]。
3.2 kupffer细胞在机体防御和肝细胞损伤中的作用
kupffer细胞寄居于肝血窦内皮细胞之间或之上，是体内固定型巨噬细胞中最大的群体，占巨噬细胞总数的80%～90%，约占肝细胞总数的15%[9]。kupffer细胞的主要生理功能包括吞噬和清除功能，能吞噬和清除进入肝脏有害于人体的外来抗原、某些有害物质以及分泌前列腺素和氧化类物质，杀灭肿瘤细胞。以往研究发现，牛磺酸和支链氨基酸对四氯化碳所致的肝细胞损伤具有保护功能，其保护作用可能是通过抗脂质过氧化作用实现的[10]。在病理情况下，多种因素致使kupffer细胞活化，活化后其功能则明显增强，可合成和分泌多种生物活性物质，释放的大量促炎递质如tnfα、il1、il6、il8、氧自由基、一氧化氮以及花生四烯酸代谢产物等，能够参与机体的炎症反应和免疫反应，导致和加重肝细胞的损伤[11]。kupffer细胞能够通过表达fasl，与肝细胞表面的fas直接结合，诱导肝细胞凋亡[12]。kupffer细胞还能募集中性粒细胞和淋巴细胞进入肝组织，加重肝细胞损伤。鉴于kupffer细胞在肝脏功能中的重要作用，建立适宜的肝细胞kupffer细胞体外培养体系，对于进行肝细胞移植、肝细胞功能和药物代谢等的研究有重要意义。本实验kupffer细胞生长良好，保持il1、il6、tnfα等细胞因子分泌功能。
3.3 共同培养体系中 kupffer细胞对肝细胞影响
共同培养体系即是将两种细胞(可以来自同一组织，亦可以来自不同的组织)混合共同培养，从而使其中一种细胞的形态与功能稳定表达，并维持较长的时间。原代肝细胞培养体系中由于分离过程的影响，总会有一些非实质细胞的污染。在复杂的细胞培养体系中，星形细胞来源的纤维母细胞和其他细胞也可以产生细胞外基质和细胞因子，从而建立起局部区域而支持肝细胞增殖或分化培养。本实验研究结果表明，肝细胞和kupffer细胞按6∶1的比例同步贴壁共培养，肝细胞在体外的生存时间和活性会受到一定的影响;共同培养组细胞培养基中的alt、ast释放明显增加，说明kupffer细胞能诱导肝细胞的损伤。清蛋白由肝脏合成，因此清蛋白浓度可以反映肝脏的功能。以往研究发现，活化的肝内非实质细胞产生tnfα、il6等细胞因子诱导肝细胞清蛋白合成的下降[13]。本研究显示，共同培养组清蛋白水平低于单独培养组，同时共同培养组检测到有il1、il6、tnfα产生，而单独培养组未检测到三者，提示kupffer细胞与肝实质细胞体外共同培养时，通过分泌il1、il6、tnfα使肝细胞蛋白合成功能受损。
本实验研究了kupffer细胞与肝实质细胞体外共同培养时，肝实质细胞生长、形态及功能的损伤情况，但其具体机制目前并不清楚。kupffer细胞和肝细胞的相互作用及其结果值得深入、全面地研究。
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