抑癌基因lkb1在胃癌组织表达及意义
【关键词】 胃肿瘤；lkb1基因；基因表达；免疫组织化学
【摘要】 目的 探讨抑癌基因lkb1在胃癌组织表达及意义。方法 应用免疫组织化学方法检测60例胃腺癌组织（胃癌组）、16例正常胃黏膜组织（正常组）和21例癌旁胃黏膜组织（癌旁组）标本lkb1的表达，并分析其与肿瘤临床病理特征的关系。结果 lkb1正常组100.0%强阳性表达，癌旁组61.9%强阳性、38.1%弱阳性表达，胃癌组46.7%弱阳性表达，各组间比较差异有显著性（h=60.412，p<0.001）。胃癌组lkb1阳性表达与pt分期及分化程度有关（χ2=9.386、4.275，p<0.05)，与病人年龄、性别、大体分型、解剖位置及淋巴结有无转移无关（p>0.05）。结论 lkb1基因表达与胃癌存在密切关联，检测其在胃癌组织或胃癌细胞中的表达，可为胃癌的诊断提供参考依据。
【关键词】 胃肿瘤；lkb1基因；基因表达；免疫组织化学
the expression and its significance of antioncogene lkb1 in gastric cancer
ge mingzhu, cui tao, liang jun
(department of oncology，the affiliated hospital of qingdao university medical college，qingdao 266003, china);
［abstract］ objective to study the expression of antioncogene lkb1 in gastric cancer and its significance. methodsusing immunohistochemical technique, specimens obtained from 60 patients with gastric adenocarcinoma, 16 from normal gastric tissue and 21 from paraneoplastic were detected for lkb1 expression. the association of the expressions with clinical pathology was analyzed. results the expressions of lkb1 in different groups were as follows: in the normal gastric tissue, 100.0% were strongly positive; in the paraneoplastic, strongly positive accounted for 61.9%, weakly positive 31.8%; in the cancer, 46.7% were weakly positive, the differences among the groups being significant (h=60.412,p＜0.001）. in the cancer group, the positive expression of lkb1 was related with pt staging and cell differentiation (χ2=9.386,p<0.01), but not associated with patient’s age, sex, general typing, anatomical position and with or without lymph node metastasis (p>0.05). conclusion the expression of lkb1 is closely related with gastric cancer. the detection of lkb1 in the cancer tissue would provide a reference evidence for the diagnosis of this disease.
［key words］ stomach neoplasm; gene, lkb1; gene expression; immunohistochemistry
lkb1基因又被称为stk11基因,是一种抑癌基因[1],编码一种丝氨酸苏氨酸蛋白激酶,lkb1基因的表达产物是一种在细胞内分布较为广泛的蛋白质,它在细胞的多种生命活动中起着非常重要的作用，而且与多种肿瘤的发生关系密切[2]。www.11665.Com目前, 对lkb1蛋白在胃癌组织的表达情况了解不多，其表达对预后的影响尚不完全清楚。本文应用免疫组织化学方法检测lkb1在胃癌、癌旁及正常胃黏膜组织中的表达情况,并分析其表达与肿瘤临床病理特征的关系。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本及其来源
胃癌组织标本（胃癌组）60例，取自青岛大学医学院附属医院2008年6—12月胃腺癌根治术病人，男39例，女21例，年龄31～85岁，平均65岁；其中低分化腺癌44例，中分化腺癌16例。癌旁胃黏膜标本（癌旁组）21例，男13例，女8例，年龄42～80岁，平均61岁。正常胃黏膜标本（正常组）16例，男11例，女5例，年龄31～62岁，平均46岁，为距离胃腺癌病灶5 cm以外的正常胃黏膜组织。所有病人均经病理学检查确诊，术前均未行放化疗及其他抗肿瘤治疗。
1.2 主要试剂
检测所用特异性一抗为鼠抗人lkb1单克隆抗体ab15095，为美国abcam公司产品，工作浓度1∶100。即用型免疫组化elivision plus试剂盒（鼠兔）为福州迈新生物技术开发有限公司产品，内含聚合物增强剂，二抗辣根过氧化物酶标抗鼠兔聚合物，工作浓度1∶100。dab显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。
1.3 lkb1表达检测
采用免疫组化非生物素即用型二步法。每例标本石蜡连续切片2张，厚度1～2 μm，1张行常规苏木精伊红染色，采用盲法请一位病理科医师行病理诊断；另一张做lkb1抗原免疫组化染色。非生物素即用型二步法染色严格按照试剂盒说明书操作，dab显色，苏木精复染，中性树胶封片。以pbs代替一抗作为阴性对照。
1.4 免疫组化结果判断
光学显微镜下观察，细胞核和胞质中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。每张切片均由两位病理医师在高倍镜下随机观察10个视野，综合考虑切片中阳性细胞着色强度和阳性细胞占所观察同类细胞数的百分比两项指标,半定量判断结果。着色强度：基本不着色为0分，着色淡者为1分，棕黄色为2分，棕黑色为3分。根据阳性细胞在观察细胞中所占比例分为：阳性细胞数≤10%为0分，11%～30%为1分， 31%～60%为2分，>60%为3分。将两者的得分相乘，0～1分为阴性，2～3分为弱阳性，4分以上为强阳性。
1.5 统计分析
采用spss 11.5及ppms 1.5[3]统计学软件进行数据处理，多组等级资料比较应用秩和检验，计数资料的比较采用卡方检验。以p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组lkb1表达比较
lkb1蛋白在胃癌组、癌旁组及正常组胃黏膜组织中均有表达,其阳性染色呈棕黄色颗粒弥漫性分布于细胞质和细胞核。lkb1在正常组、胃癌组、癌旁组表达的比较,差异有显著意义（h=60.412,p<0.001）。见表1。表1 各组lkb1表达比较（略）
2.2 胃癌lkb1表达与临床病理特征的关系
lkb1的表达与胃癌的临床分期、组织学类型有关，pt分期高者lkb1基因表达阳性率低于pt分期低者（χ2=9.386，p<0.001），低分化者lkb1基因表达的阳性率低于中分化者(χ2=4.275，p<0.05)。lkb1基因蛋白表达与病人年龄、性别、大体分型、解剖位置及淋巴结转移无关（χ2=0.005～2.402，p>0.05）。见表2。表2 lkb1表达与胃癌临床病理特征的关系（略）
3 讨论
据parkin等[4]报道，2002年全世界新诊断的恶性肿瘤病例数为1 090万，因癌症死亡病例数为670万，其中胃癌新发病例数为93.4万，而死亡病例数70万，仅次于肺癌占第二位。中国为胃癌高发地区。本课题拟通过研究lkb1基因表达与胃癌的关系，为胃癌的诊断和治疗提供新的参考指标。
lkb1基因由芬兰和德国学者于1998年克隆得到,该基因定位于人染色体的19p13.3,几乎所有的人体组织均有lkb1 rna 表达。lkb1的编码产物是一相对分子质量为60 000 的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶,由433个氨基酸组成,其中第43～88 氨基酸残基为其核定位信号(nls) 序列。lkb1既可通过nls定位于细胞核,也可通过与lip1或strad作用而锚于细胞质[5]。本文免疫组化结果也显示,lkb1在正常胃黏膜、癌旁及胃腺癌组织的细胞核与细胞质均有表达。
最近的研究结果表明，lkb1与多种肿瘤的发生关系密切，目前已普遍认为lkb1基因是一种抑癌基因。sobottka等[6]对309例脑原发性和继发性肿瘤进行了lkb1基因的杂合性丢失分析，结果显示，在脑转移瘤中lkb1基因杂合性丢失的比例相当高，在脑转移性乳癌中为56.3%，而在脑转移性肺癌中为58.3%。nakaum等[7]研究显示，lkb1基因敲除雄性小鼠易发生肝细胞癌，在大于50周的lkb1基因敲除小鼠中有超过70%发生了肝细胞癌，雌性小鼠发生肝细胞癌的比例为20%，western、pcr检测均证实所有研究组小鼠的肝细胞癌组织中都存在lkb1活性的缺失。在原发性肺腺癌组织中lkb1基因发生突变的频率相当高，其中主要是无义突变，这说明至少有部分原发性肺腺癌的发生与lkb1基因的活性丧失有关[8]。通过对lkb1基因敲除小鼠模型的研究证实，lkb1基因的功能缺失与肿瘤的发生相关[9]。但lkb1在肿瘤发生和发展中的作用有待于进一步研究。antti等[2]对小鼠胚胎的研究结果显示，lkb1基因缺如者血管生成和发育异常，并认为其中之一是vegf介导的。vegf过表达与癌症的侵袭和血管密度密切相关，是一个最具普遍意义的肿瘤微血管生成刺激因子。vegfc及其受体flt4在胃癌的发生发展过程中可能起一定的作用，两者高表达可能与胃癌淋巴结的转移有关[10]。因此，研究lkb1在胃癌组织的表达，为进一步探索胃癌的发病机制及其诊断和治疗具有重要的现实意义。
本研究结果显示，lkb1在正常组100.0%强阳性表达，癌旁组85.7%强阳性表达、14.3%弱阳性表达，胃癌组46.7%弱阳性表达，各组间lkb1表达差异有显著性。lkb1基因在胃癌、癌旁及正常胃黏膜组织表达呈现梯度变化，提示该基因具有抑制胃癌细胞生长的作用。在本研究60例胃腺癌组织标本中，lkb1基因阴性表达的32例多为分化差、tnm分期较晚者，提示此类病人可能发生lkb1基因功能受损，从而导致lkb1抑制肿瘤细胞生长和增殖的作用不能正常发挥，最终导致肿瘤发生，进一步证实了其作为肿瘤抑制基因的作用。在lkb1基因阳性表达的28例胃癌组织标本中，pt分期高者表达阳性率低于分期低者，低分化者表达阳性率低于中分化者，但与病人年龄、性别、大体分型、解剖位置及淋巴结有无转移无关，提示lkb1参与了胃癌的发生发展。
综上所述， lkb1基因表达与胃癌存在密切关联，检测其在胃癌组织或胃癌细胞中的表达，可为胃癌的分期、病理分型、诊断提供参考指标。但能否为胃癌的治疗提供新的、可能的分子靶点有待于进一步研究。
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