【摘要】 目的 研究sirna mdm2对人前列腺癌细胞pc3的mdm2表达和细胞增殖的作用。方法 构建pgcsilencertmmdm2 sirna，并转染入pc3细胞,分别用rtpcr和western blot检测simdm2对pc3细胞mdm2基因和蛋白表达的抑制作用；用mtt法检测simdm2对pc3增殖抑制的作用，用流式细胞术检测simdm2对pc3细胞凋亡的影响。结果 ptpcr和western blot结果显示simdm2能显著抑制pc3细胞mdm2基因和蛋白的表达，抑制率最高可达65%;mtt和流式细胞术结果证明simdm2能显著抑制pc3细胞增殖并诱导细胞凋亡。结论 simdm2能特异有效地抑制mdm2在pc3中的表达，并抑制pc3细胞增殖，促进其凋亡。
【关键词】 sirna; mdm2; 前列腺癌; rtpcr; 流式细胞术
sirna inhibits mdm2 expression and cell proliferation in pc3 cell line
li ranwei1，zhao yanying2，yang zecheng3, zhang duoduo4, lv jiayin5, liu xichun4
1.department of urinary surgery，the second hospital of jilin university，changchun 130041，china；2. department of internal medicine, shenzhen shekou peodle's hospital；3. department of surgery, chinajapan union hospital of jilin university, 4. department of radiotherapy, 5. department of orthopedics
corresponding author: zhao yanying, emai l:[email protected]：objective to study the effect of sirna to mdm2 on cell proliferation and mdm2 expression in prostate the cancer cell pc3. methods pgcsilencertmmdm2 sirna was constructed and transfected into the pc3 cells. mdm2 gene expression was detected by rtpcr and protein expression was analyzed using western blot. the inhibitory effect on cell proliferation was determined by mtt assay. the cell apoptosis was observed by flow cytometer. results the results of rtpcr and western blot showed that the expression of mdm2 was inhibited in the sirna transfected group and the highest inhibitory rate was 65%. the results of mtt and flow cytometer showed that sirna could suppress the proliferation and induce apoptosis of pc3 cells. conclusion sirna of mdm2 could significantly inhibit mdm2 expression, the proliferation of pc3 cells and induce apoptosis of pc3 cells.
key words：sirna; mdm2; prostate cancer; rtpcr;flow cytometry
前列腺癌是50岁以上男性中最常见的恶性肿瘤[1]。WwW.11665.Commdm2癌基因在许多癌症都过表达，包括前列腺癌、肉瘤、血液恶性肿瘤、乳腺癌和结肠癌[2]。sirna技术的有效和特异基因阻断特点,使其在肿瘤治疗上的应用已成为研究的热点。本文主要研究sirna mdm2对pc3人前列腺癌细胞mdm2表达、增殖和凋亡的影响，为基因治疗前列腺癌提供新的思路和实验依据。
1 材料方法
1.1 材料
胎牛血清,imdm培养基购自gibco公司;silencer sirna construction 试剂盒购自ambion公司;lipofectaminetm 2000转染试剂和trizol试剂购自invitrogen公司; rtpcr试剂盒购自takara公司;mtt为sigma公司产品;兔抗人mdm2多克隆抗体和碱性磷酸酶标记羊抗兔igg多克隆抗体均购自美国santa cruz公司。
1.2 sirna重组质粒构建及鉴定
根据已知genebank mdm2 mrna序列和sirna的设计原则[3],利用ambion公司的在线设计来寻找靶序列,并排除和其他编码序列或est同源的序列,sirna和靶序列，见表1。用silencer sirna construction kit体外合成针对人mdm2基因序列特异的si mdm21、si mdm22和si mdm23,严格按照试剂盒工作手册进行操作，阴性对照control sirna与任何编码序列无同源性购于ambion。将pgcsilencertmmdm2 sirna用hind ⅲ/bam hⅰ双酶切鉴定，并将0.8ml培养扩增(摇至对数晚期)的细菌加甘油0.2ml,送上海生工检测核苷酸序列。表1 sirna 序列
1.3 细胞培养及转染
人前列腺癌细胞pc3购自中国科学院上海细胞生物学研究所。pc3细胞于imdm培养液(含10%胎牛血清,青霉素100μg/ml,链霉素100μg/ml),37℃、 5% co2孵箱内培养。转染前取对数生长期细胞用无抗生素imdm培养,待细胞达80%～95%融合时分组转染：空白组（只加转染试剂）、对照组（转染control sirna）和simdm2实验组（分别转染simdm21、simdm22、simdm23）。严格按lipofectaminetm2000试剂说明书进行操作。
1.4 逆转录聚合酶链反应（rtpcr）
收集转染48h后各组细胞（转染3组simdm2的终浓度为1.6mg/l,转染control sirna的control和空白组mock），按trizol操作说明,提取个组细胞总rna。逆转录反应合成cdna第一链后以βactin为内参照进行pcr 反应,mdm2扩增片断长度300bp上游引物为5′aaccacctcacagattccag3′, 下游引物为5′tcaaggtgacacctgttctc3′；βactin扩增产物为520bp，上游引物为: 5′gggacctgacagactacct3′下游引物为：5′cgtactcctgcttgctga3′（引物序列设计合成均由上海生工完成）。所有操作均按rt－pcr试剂盒说明书进行，pcr反应条件为: 94℃预变性5min; 94℃ 30s, 56℃ 45s,72℃ 1min 共28个循环; 72℃延伸7min。取10μl产物1%琼脂糖凝胶电泳,对照分子量标准检测扩增结果,用凝胶成像仪观察分析条带峰面积来反映mdm2表达的变化。
1.5 蛋白免疫印迹（western blot）
收集转染72h后各组细胞（分组同rtpcr）,用pbs洗一次，按1×107细胞加入100μl预冷的裂解液,轻微超声粉碎细胞，低温离心30min,上清即总蛋白。用bradford法蛋白定量后,取50μg蛋白上样,通过12% sdspage分离后转至pvdf膜上,脱脂奶粉封闭4℃过夜；加入兔抗人mdm2抗体(1∶500),4℃过夜；用tbst洗膜10min,3次,加入1∶2 000稀释的羊抗兔二抗,室温振摇1h,tbst洗膜后,显色,至理想条带出现,水冲洗,照相。用图像分析系统测定各条带灰度值,来反映mdm2蛋白的表达变化。
1.6 mtt法检测pc3细胞的增殖能力
（1）剂量效应：取对数生长期细胞，接种于96孔板（每孔1×104个细胞）,转染3个浓度（0.8、1.6、3.2mg/l）的simdm2和control sirna,并设空白组,转染48h后每孔加入15μl mtt(5mg/ml)继续培养4h, 再加入150μl的dmso,振荡10min,酶标仪570nm测定吸光度(a)值。（2）时间效应：取对数生长期细胞, 接种于96孔板（每孔5×103个细胞）,转染simdm2(使其终浓度达1.6mg/l)和control sirna,并设空白组。分别于转染24、48、96h后,每孔加入15μl mtt(5mg/ml)继续培养4h,再加入150μl的dmso,振荡10min,酶标仪570nm处测定吸光度(a)值。根据公式:细胞增殖抑制率(%)=(1-处理组吸光度)/未处理组吸光度）×100%,计算出抑制率。每组3复孔,并重复3次。
1.7 流式细胞术分析细胞凋亡变化
转染72h后,收集转染1.6mg/l的3个simdm2实验组,对照组和空白组细胞,注意将培养上清中和贴壁生长的细胞一并收集，pbs洗两次, 分散成单细胞悬液,用-20℃预冷的70%乙醇4℃固定过夜。上机前离心收集细胞,细胞团重悬于pbs中, 20μg/ml碘化丙啶(pi),使终浓度为100μg/ml,37℃避光染色30min,上流式细胞仪检测。
1.8 统计学方法
本实验数据采用spss 11.0统计学软件，行χ2检验和方差分析。
2 结果
2.1 重组质粒的鉴定
（1）重组质粒的酶切鉴定：pgcsilencertmmdm2 sirna经hind ⅲ/bam hⅰ双酶切后2%琼脂糖电泳，出现两条电泳带,分别为大片段的载体片段和约63bp的目的片段，见图1,说明成功构建重组质粒。（2）重组质粒的测序鉴定：测序引物根据载体序列设计为:5′aagaagagagtgtggaatcta3′，测序结果与目的序列相同，序列完全正确，进一步表明pgcsilencertmmdm2 sirna构建成功。
2.2 mdm2 mrna rtpcr 结果
mdm2和βactin扩增产物经电泳和eb染色后,结果显示扩增片段大小与所设计的大小完全一致,分别为300bp和520bp。转染simdm21、2、3的pc3中mdm2 mrna的表达量较对照组和空白组有不同程度的下调，而对照组和空白组的mdm2 mrna表达差异无统计学意义(p＞0.05)，见图2。对照组和转染simdm21、2、3组的mdm2扩增产物的强度与内参照βactin的比值分别为(0.986±0.032)、(0.354±0.054)、(0.445±0.065)和(0.768±0.084)，simdm21、2组与对照组比mdm2表达差异有统计学意义(p<0.01, n=3)。转染simdm21、2、3组的mdm2表达水平分别下调为空白组的35.4%, 44.1%和76.8%。
2.3 mdm2蛋白western blot结果
转染simdm2的pc3细胞mdm2蛋白表达被抑制,而βactin不受影响。与空白组比,转染simdm21、2、3后,细胞所表达的mdm2蛋白量有不同程度的减少, 而转染control sirna的蛋白表达差异无统计学意义（p＞0.05），见图3，表明simdm2可以有效特异的抑制mdm2蛋白的表达。与空白组比转染simdm21、2后mdm2蛋白分别下降了63.5%和55.8%,差异有统计学意义(p<0.01, n=3)，转染simdm23的pc3细胞mdm2蛋白下降了29.0％，和mdm2 mrna下降趋势基本相同。
rtpcr和western blot结果推断:可能由于sirna抑制肿瘤细胞mdm2 mrna表达,而导致肿瘤细胞mdm2蛋白合成减少,也就是说肿瘤细胞合成mdm2蛋白下降是由于sirna抑制mdm2基因表达的结果。
2.4 细胞增殖抑制实验结果
不同浓度simdm2转染pc3细胞48h后,可见抑制率随浓度的增加而增高(p<0.05),具有剂量依赖性，见图4。1.6mg/l的simdm2转染pc3细胞24、48、96h后,抑制率随时间的增加而增高(p<0.01),具有时间依赖性，见图4。simdm2的抑制率和空白组比较差异有统计学意义（p<0.01）;阴性对照组的抑制率和空白组比较差异无统计学意义（p＞0.05）。
2.5 流式细胞计数仪检测细胞凋亡
流式细胞术分析表明, 与空白组相比, 转染control sirna的pc3未检测到凋亡， 转染simdm21、simdm22的pc3凋亡非常显著,细胞凋亡率分别为42.5%和33.9%，而且细胞周期的百分比发生了变化，pc3细胞g0/g1期细胞百分数提高36%,s期细胞减少34%,g2～m期细胞百分数减少了20.07%。而转染simdm3诱导pc3凋亡的效果没有simdm21和2显著，见图5。
3 讨论
有研究表明前列腺癌的发生与原癌基因和（或）抑癌基因失衡有关，细胞动力学研究证实,前列腺癌发病是由于细胞增殖和凋亡失衡而导致的细胞数目增加[4]。mdm2是一个与前列腺癌密切相关的癌基因，mdm2可使前列腺细胞异常转化而具有成瘤性,并促进移植瘤的快速形成[5]。前列腺癌组织中mdm2的异常扩增和过表达可导致野生型p53的抑癌活性丧失。mdm2直接结合p53形成一个“负反馈调节环”，mdm2抑制p53的转录活性严格控制p53蛋白水平，mdm2表达过强可封闭p53介导的反式激活作用使p53功能丧失[67]。
应用sirna技术有针对性地封闭在细胞癌变过程中发挥重要作用的癌基因,使其表达降低,癌细胞生长受抑制,从而达到治疗的目的[8]。现有的研究证实了sirna在体外和体内水平抗肿瘤治疗的有效性,虽然sirna 在临床肿瘤治疗上的应用还有待于进一步研究,但与反义rna技术相比, sirna具有稳定性好、特异性强、细胞毒性低以及作用持久、强大等优点,这些优点使sirna成为研究基因功能、治疗肿瘤的有力工具,开辟了治疗癌症、遗传病等多种疾病的一条新途径。
本文构建了针对mdm2的sirna真核表达载体,并将其转染至pc3细胞内。rtpcr和western blot结果表明simdm21和simdm22可以显著地抑制mdm2基因、蛋白的表达，效率最高可达65%左右。同时mtt和流式细胞检测结果证实了simdm21、simdm22可明显地诱导pc3细胞凋亡和降低pc3增殖活性，而simdm23的抑制效果没有simdm21和2明显,这可能因为并不是所有的sirna都能够接近靶序列rna。转染control sirna的细胞和空白组比mdm2表达没有受到抑制，也没有诱导细胞凋亡产生。以上结果表明simdm2使mdm2基因、蛋白表达受到了抑制，而由此促进了癌细胞增殖抑制及凋亡。mdm2降解可以恢复和提高细胞p53水平,增强p53在g1～s期和g2～m期的限制点效应,最终使细胞阻滞于g1期和g2期，从而触发细胞凋亡。所以mdm2可作为前列腺癌基因治疗的一个较好的靶位点,sirna技术可作为肿瘤基因治疗的新策略，从而为前列腺癌的基因治疗提供理论基础。
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