【摘要】 目的探讨reprimo以及1433 σ基因启动子在非小细胞肺癌（nsclc）中的异常甲基化状态及其与临床病理资料的联系。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应（methylation specificpcr,msp）技术检测60例nsclc以及癌旁正常组织中reprimo以及1433 σ基因启动子异常甲基化状态。结果reprimo以及1433 σ基因启动子异常甲基化在nsclc组织中发生频率分别为36.67％(22/60)和28.33%(17/60)，与癌旁正常组织具有显著性差异（p值分别为0.000和0.002）。reprimo基因启动子异常甲基化频率与吸烟习惯以及年龄相关；1433 σ启动子异常甲基化与年龄、吸烟习惯、性别、病理类型和临床分期以及淋巴结转移等无相关。结论nsclc中存在reprimo和1433 σ等基因启动子较高频率的异常甲基化。
【关键词】 肺癌;甲基化;reprimo基因;1433 σ基因
detection of aberrant methylation of reprimo and 1433 σ genes in nonsmall cell lung cancer
jiang rui，yu shiying
cancer center of tongji hospital, tongji medical college, huazhong science and technology university, wuhan 430030, china
corresponding author: yu shiying, email: [email protected] abstract：objective to investigate the frequency of aberrant methylation of reprimo and 1433 σ in nonsmall cell lung cancer (nsclc).methodsaberrant methylation of reprimo and 1433 σ were examined by methylation specificpcr (msp) in primary nsclc and normal lung tissues (n = 60).resultsaberrant methylation of reprimo and 1433 σ were found to be present in 36.67％ and 28.33% of all nsclc patients respectively.three cases of aberrant methylation of reprimo(5%) and 4 cases of 1433 σ(6.67%) were detected in normal lung tissues. the frequencies of aberrant methylation of reprimo and 1433 σ between primary nsclc and normal lung tissue group were significantly different. aberrant methylation of reprimo was more frequently observed in older patients group (p=0.047) and smoking group (p=0.038). there was no significant correlation between reprimo methylation frequencies and sex, pathology type, clinical staging and lymphatic metastasis. similarly no significant association was found between 1433 σ methylation frequencies and sex, age, pathology type, clinical staging, smoking habit and lymphatic metastasis.conclusionmethylation of reprimo and 1433 σ may play an important role in the pathogenesis of nsclc.
key words：lung cancer; methylation; reprimo; 1433 σ
tab 1primer sequence of reprimo and 1433σgene forward primer reverse primer product1433σm tggtagtttttatgaaaggcgtc cctctaaccgcccaccacg 105bp1433σu atggtagtttttatgaaaggtgtt ccctctaaccacccaccaca 107bpreprimom gcgagtgagcgtttagttc tacctaaaaccgaattcatcg 112bpreprimou ttgtgagtgagtgtttagtttg taattacctaaaaccaaattcatc 112bp
1资料与方法
1.1资料
1.1.1病理标本60例nsclc组织以及相应的癌旁无瘤肺组织标本来自华中科技大学附属同济医院2005~2006年肺癌手术切除患者，组织经短时福尔马林固定后取材，放入-20℃冰箱保存备用。Www.11665.cOm肿瘤组织采集时避开肿瘤的液化坏死部分，对应的癌旁无瘤组织标本取材自距离肿瘤组织5cm以上的正常肺组织。60例患者术前均未进行放、化疗。其中男41例，女19例，年龄34~73岁，平均年龄53.6岁。肿瘤组织均经过病理学证实。按who标准分类，鳞癌32例，腺癌28例。ⅰ期15例，ⅱ期26例，ⅲ期19例。淋巴结转移22例，未发生淋巴结转移38例。
1.1.2试剂盒和试剂dna提取试剂盒以及50bp dna ladder marker购自tiangan公司，dna 修饰试剂盒购自chemicon 公司，dna 聚合酶购自大连宝生物takara公司，sssⅰ甲基转移酶购自美国neb公司。
1.1.3引物reprimo以及1433σ设计参照参考文献[12]，由上海生工合成，引物序列，见表1。
1.2试验方法
1.2.1组织dna的提取按试剂盒说明书提取。
1.2.2基因dna的亚硫酸氢盐修饰其原理是标本dna经亚硫酸氢盐处理后，所有的非异常甲基化的胞嘧啶都会发生脱氨基作用而转变成尿嘧啶，而异常甲基化的胞嘧啶则不被修饰，仍保持5’甲基胞嘧啶状态。操作按照chemicon公司gpgenome dna modification kit说明书进行。
1.2.3甲基化特异性聚合酶链反应经亚硫酸氢钠修饰的dna进行甲基化特异性聚合酶链反应（methylation specific pcr,msp），检测 reprimo以及1433 σ 基因是否异常甲基化。 pcr使用20μl反应体系，10×pcr buffer 2μl，2.5mmol/l dntps 2μl，上下游引物各1μl，taq酶2μl，模板2μl，ddh2o补足20μl。冰上配制pcr反应液，至pcr仪预热至94℃，将反应体系放入pcr仪。反应条件为94℃ 15min，94℃ 30s，56℃/reprimo(60℃/ 1433σ)45s，72℃ 45s，共40个循环；72℃延伸10min。经sssⅰ甲基转移酶修饰的正常人外周血dna作为异常甲基化pcr的阳性对照，以等量灭菌ddh2o作为阴性对照。pcr反应结束后，取5μl 反应产物与0.5μl上样缓冲液混合，点样于含0.15mg/l eb的 3％琼脂糖凝胶中，80v电泳40min，电泳液为1×tae。以50bp ladder 为分子量标准，凝胶成像系统进行摄像。
1.2.4结果判定甲基化特异性扩增产物存在为甲基化阳性；反之则为甲基化阴性，但是必须非甲基化特异性扩增产物同时存在，才可以判断为甲基化阴性。若甲基化特异性扩增产物与非甲基化特异性扩增产物同时存在，则认为是存在基因的半甲基化状态，即dna双链中仅有一条链处于甲基化状态,而另一条链未甲基化。
1．3统计学方法应用 spss11.0 软件进行χ2 检验，以p<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1reprimo基因启动子异常甲基化在肿瘤及癌旁组织中的发生情况60例nsclc组织中，22例（36.67％）检测到reprimo基因启动子异常甲基化，见图1，而对应癌旁正常组织仅发现3 例（5％），基因启动子异常甲基化发生频率比瘤旁正常组织显著增高（χ2=18.24，p＝0.000）。
2.21433 σ基因启动子异常甲基化在肿瘤及癌旁组织中的发生情况60例nsclc组织中，检测到1433 σ基因启动子的异常甲基化17例（28.33％），见图2，而对应癌旁组织仅发现4例（6.67％），1433 σ基因启动子异常甲基化频率比瘤旁组织显著增高（χ2＝9.755，p＝0.002）。
2.3reprimo基因和1433 σ基因启动子的异常甲基化情况与临床病理资料的关系reprimo和1433 σ基因启动子异常甲基化之间无相关性（spearman相关分析r＝-0.95,p＝0.472）。reprimo基因启动子异常甲基化与年龄、吸烟习惯有显著相关性，与性别、病理类型和临床分期以及淋巴结转移等无相关；1433 σ启动子异常甲基化与年龄、吸烟习惯、性别、病理类型和临床分期以及淋巴结转移等无相关，见表2。
3讨论
dna异常甲基化是表观遗传修饰的主要方式，它不改变dna 的一级结构，而在细胞的发育、基因的表达、及基因组的稳定性中起着重要的作用。启动子异常甲基化是除突变和缺失外肿瘤中抑癌基因失活的第三种机制。近年来研究表明dna异常甲基化导致的抑癌基因失表达在肺癌的发生和发展过程中发挥着重要的作用。reprimo是在用x 线照射后的细胞中分离出的一种新基因，p53可诱导reprimo mrna表达[1]。过表达reprimo引起细胞周期停滞于g2期，使细胞不能增生。reprimo可能是通过抑制cdc2活性以及cdc2/cyclinb1复合物核转位的途径来发挥作用[1]。reprimo 启动子异常异常甲基化可造成其转录抑制[1,3] ,引起g2/m检查点调控的紊乱。1433σ蛋白属于1433蛋白家族的一员，在哺乳动物细胞中1433蛋白家族一共包含7 种类型，在细胞内通过与磷酸化蛋白鳌合来调节细胞活性[4] 。1433σ使存在dna 损伤的细胞停滞在g2/m 检查点，其表达为肿瘤抑制基因p53所调控[2]。启动子异常甲基化产生的1433σ表达沉默将使细胞失去鳌合启动有丝分裂的cdc2/cyclinb1复合物的能力，使受损的dna 仍然能通过g2/m检查点。reprimo以及1433σ两基因沉默均可以引起g2/m检查点调控的紊乱，导致细胞异常增生。本研究检测了非小细胞肺癌组织中reprimo、1433 σ基因启动子的异常甲基化情况。msp显示nsclc组织中reprimo以及1433σ基因启动子异常甲基化频率显著高于癌旁正常组织。在5例nsclc组织中检测到两基因启动子异常甲基化同时存在，全部60例nsclc组织中，两基因启动子异常甲基化总的发生率达56.67％，提示由此两基因在肺癌中存在较高频率的异常甲基化，由此导致的细胞周期紊乱，可能参与了肺癌的发生。两基因异常甲基化频率在不同临床分期标本中，均无显著性差异，且与淋巴结是否发生转移无关，提示两基因启动子异常甲基化可能是肿瘤发生发展的早期事件，可以作为肺癌早期诊断的敏感生物学指标。本研究发现reprimo基因启动子的异常甲基化频率与患者年龄相关，大于60岁患者组基因启动子异常甲基化频率大大增加。研究表明作为一种表观遗传改变，dna异常甲基化率随着年龄增长而升高[5]。可能随着年龄的增长，各种内外因交互作用的不断积累，最终影响到reprimo基因的异常甲基化水平，这可能是肺癌的发病机制之一。另外，吸烟患者组reprimo基因启动子异常甲基化频率高于无吸烟史者。有研究认为烟草中的致癌物是导致基因异常甲基化发生的重要诱因，而且烟草的致癌物一旦导致基因发生异常甲基化将持续存在，并不因吸烟的中断而发生异常甲基化逆转[6]。 因此吸烟对基因启动子异常甲基化的影响作用比较显著，reprimo基因可能作为烟草致癌物的作用靶点参与了肺癌的发生。1433 σ启动子异常甲基化未发现与各项临床病理资料相关，也许需要进一步扩大样本范围进行研究。reprimo和1433 σ基因均可受肿瘤抑制基因p53调控，本研究发现两者启动子异常甲基化无相关性。目前关于两基因具体作用机制仍未完全阐明，提示在调控细胞周期过程中，两基因可能各自处于独立的信号通路。综上所述，reprimo以及1433σ两基因dna启动子异常甲基化导致的细胞周期紊乱可能参与了肺癌的发生。与基因突变等遗传学改变不同，dna启动子异常甲基化是一个相对可逆的过程[7]。研究发现，利用去甲基化药物，可以恢复抑癌基因的功能，重新发挥抑制肿瘤的作用，为治疗肺癌提供了新的生物学途径。因此，对dna 甲基化研究的深入，不仅有助于进一步了解肺癌发生发展的复杂过程，而且将会为肺癌的遗传学治疗开辟更为广阔的前景。
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［３］suzuki m，shigematsu h，takahashi t，et al.aberrant methylation of reprimo in lung cancer[j].lung cancer,2005,47(3)：309314.
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