【摘要】 目的 探讨细胞块免疫细胞化学在诊断转移腺癌原发灶中的临床价值。方法 选取手术后有病理组织学结果对照，并且淋巴结穿刺后已做细胞块的肿瘤患者150例，其中肺腺癌30例、卵巢癌30例、肠癌30例、胃癌30例、乳腺癌30例。用细针穿刺淋巴结获取标本，用血浆凝血酶的方法制成细胞块，抗体组选择ttf1、ca125、cdx2、villin、gcdfp15 5种抗体。结果 肺腺癌的淋巴结中ttf1阳性率达90%，卵巢癌的淋巴结中ca125阳性率达90%，肠癌的淋巴结中cdx2阳性率达93%, villin 阳性率达76%, 胃癌的淋巴结中cdx2阳性率达50%，villin阳性率达63%，乳腺癌的淋巴结中gcdfp15 阳性率达86%。结论 用血浆凝血酶的方法做成的细胞块常规切片，再与免疫细胞化学相结合，不仅能确定肿瘤性质，组织学类型，解决了一些疑难病例，而且还能够对原发灶较小，比较隐匿，而以淋巴结转移为首发症状的肿瘤患者，提示确定原发灶，帮助临床制定合理治疗方案及判断预后。
【关键词】 细胞块 免疫细胞化学 转移腺癌 原发灶
有些肿瘤患者是以淋巴结肿大为首发症状而就诊，针吸细胞学确定恶性后，患者要做各种影像学、内窥镜检查来寻找原发灶，但有时由于原发灶较小、比较隐匿，检查时不易被发现。我们采用细针穿刺淋巴结血浆凝血酶的方法做成细胞块，再与免疫细胞化学相结合，不仅能确定良恶性质，而且能提示确定原发灶。wWW.11665.COM
1 资料和方法
1.1 资料
选取2005年1月～2006年10月，在我院已做手术有组织病理学结果，并且淋巴结穿刺后已做细胞块的肿瘤患者150例，其中肺腺癌30例、卵巢癌30例、肠癌30例、胃癌30例、乳腺癌30例。其中男70例，女80例，最小年龄28岁，最大年龄72岁，平均50岁。颈部淋巴结肿大20例，锁骨上淋巴结肿大62例，腋窝淋巴结肿大22例，腹股沟淋巴结肿大46例。
1.2 细胞块的制备方法
穿刺前详细询问病史，仔细检查淋巴结位置、大小、硬度、活动度，穿刺时右手持5ml一次性注射器，刺入淋巴结，保持负压2ml不同方位穿刺，看到针芯内有乳白色或血性成分抽出即拔针，涂片2张，立即放入95％酒精湿固定30min，作he染色。剩余的标本喷到载玻片上，根据标本的多少滴上适量稀释好的凝血酶，它有促进凝固的作用，约5min待其凝固后用针头挑起放入盛有中性福尔马林固定液的塑料试管中，12h后按常规方法放入脱水盒，自动脱水机脱水，石蜡包埋，切片厚4μm。
1.3 免疫细胞化学的方法
化学试剂一抗采用福州迈新生物技术开发公司生产的ttf1、ca125、cdx2、villin、gcdfp15。检测系统采用福州迈新生物有限公司的elivision试剂盒。细胞块石蜡切片厚3～4μm，贴覆在涂有apes的胶片上，置60℃烤箱中烤片1h，梯度二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，蒸馏水浸泡5min，3％过氧化氢室温孵育10min以阻断内源性过氧化酶的活性，tbs液冲洗，微波炉抗原修复，自然冷却至室温。5％正常羊血清封闭后，分别加第一抗体30min，tbs冲洗3次，每次5min，加入二步法elivision试剂盒中的试剂a,室温下孵育20min，tbs冲洗3次，每次5min，加入试剂盒中的试剂b，室温下孵育30min，tbs冲洗3次，每次5min。镜下控制dab显色，蒸馏水冲洗终止反应。苏木素复染，盐酸酒精分化，自来水冲洗返蓝，脱水，透明，中性树胶封固。每次均作阳性对照及tbs代替一抗作阴性对照。
2 结果
血浆凝血酶法做成的细胞块he切片，细胞染色结构清晰，红蓝分明。细胞团呈乳头状，腺管状，菊形团状排列，有的单个散在，细胞较大，核浆比例失调，核膜厚，核仁明显，染色质粗，核有的偏位，有的细胞质内有分泌的粘液。免疫细胞化学诊断的标准：着色定位准确，呈明显棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。（-）：阳性细胞≤10％；（+）：11％～25％；（++）：26％～50％；（+++）：51％～75％；（++++）：76％～100％。30例肺腺癌的淋巴结中有27例ttf1阳性表达，阳性率达90％，见图1。30例卵巢癌的淋巴结中，有28例ca125阳性表达，阳性率达93％，见图2。30例肠癌的淋巴结中有28例cdx2阳性表达，阳性率达93％，有23例villin阳性表达，阳性率达76％，见图4。30例胃癌的淋巴结中有15例cdx2阳性表达，阳性率达50％，有19例villin阳性表达，阳性率达63％，见图3。30例乳腺癌的淋巴结中有26例gcdfp15阳性表达，阳性率达86％，见图5。免疫细胞化学染色结果，见表1。淋巴结位置与原发灶也有一定关系，其结果，见表2。表1 各免疫细胞化学染色结果表2 淋巴结位置与原发灶情况的比较
3 讨论
恶性肿瘤严重威胁人们的生命健康，近年发病率有逐年上升的趋势。肺癌、卵巢癌、胃癌、肠癌、乳腺癌是发病率较高的肿瘤，而且较易出现淋巴结转移[1]，早期诊断是肿瘤治愈的关键。以上肿瘤的腺癌细胞转移至淋巴结后，在细胞学形态、组织结构上相似，仅凭细胞学涂片和he切片很难判断原发灶来源。我们在针吸标本的基础上，用血浆凝血酶的方法制成细胞块，再与免疫细胞化学相结合，不仅能解决一些疑难病例，而且能够为以淋巴结为首发症状，临床检查难以发现原发灶的患者提示确定原发灶，判断预后，帮助临床制定合理治疗方案。
血浆凝血酶法制备细胞块的技术及免疫细胞化学在诊断转移腺癌原发灶方面的文献在国内鲜见报道。提高细胞块和免疫细胞化学质量和阳性率的关键是正确选择淋巴结穿刺部位和方法。（1）淋巴结穿刺不易局麻，不易选择经放疗或药物治疗过的部位穿刺，因细胞易变性、坏死，造成诊断困难。（2）多处淋巴结肿大，首选锁骨上，其次颈部、腋窝，尽可能不选择腹股沟淋巴结，因该处淋巴结多为感染所致。（3）按照淋巴结出现时间的先后，怀疑肿瘤，首选近期肿大的淋巴结，因出血、坏死较少，阳性率高，如怀疑结核应选择陈旧淋巴结价值大。（4）有大小淋巴结肿大，首选大淋巴结有价值；有活动和粘连肿大淋巴结，首选粘连部位肿大的淋巴结意义较大。（5）穿
图1 肺腺癌转移的淋巴结中ttf1呈阳性表达图2 卵巢癌转移的淋巴结中ca125呈阳性表达
图3 胃癌转移的淋巴结中cdx2呈阳性表达 图4 结肠癌转移的淋巴结中villin呈阳性表达
图5 乳腺癌转移的淋巴结中ecdfp15呈阳性表达
刺过的淋巴结，最好近期内不再做针吸细胞学检查[2]。（6）锁骨上淋巴结位置较深时，穿刺时操作较困难，特别是靠近胸膜顶，如果垂直向下穿刺，尤其是进针过深，有可能刺破胸膜而引起气胸，应斜方向进针。对颈、腹股沟等处的淋巴结要避开大血管，防止引起出血和血肿[3]。
淋巴系统转移是恶性肿瘤转移的途径之一，病变所在淋巴结回流的区域决定淋巴结肿大的位置。左锁骨上淋巴结转移常来自消化道，特别是胃癌。肺癌常转移至同侧锁骨上淋巴结。乳腺癌常转移至同侧腋窝淋巴结，卵巢癌、肠癌常转移至腹股沟淋巴结。
ttf1阳性表达较高者常见于原发和转移性肺腺癌、肺小细胞癌及神经内分泌癌[4]。而肺鳞癌、未分化大细胞癌和其他组织中ttf1阴性表达。30例肺腺癌的淋巴结中ttf1阳性率达90％。ca125主要在卵巢癌中表达[5]，其阳性率达93％。在肺癌、胃癌、乳腺癌中可有少量表达。cdx2正常表达于肠上皮和胰腺的导管和腺泡上皮[5]。在肠癌中阳性率达93％，在胃癌中可有52％表达，在卵巢癌中可有6％的表达，而在乳腺癌和肺腺癌中几乎不表达[6]。绒毛蛋白villn在胃癌中可有63％阳性表达，在肠癌中可有76％阳性表达，在肺癌中仅有3％表达，在卵巢癌和乳腺癌中几乎不表达。gcdfp15是一种高度特异和敏感的乳腺癌标志，其阳性率达86％，在卵巢癌中阳性率可达6％，在肺腺癌和胃肠癌中几乎不表达。
综上所述 ttf1、ca125、cdx2、villin、gcdfp15 5种抗体联合应用，在肺、卵巢、胃肠道、乳腺来源的转移腺癌的鉴别诊断中有一定的作用，如果ttf1阳性表达，可提示肺原发肿瘤，ca125阳性表达，可提示卵巢原发肿瘤，作为胃肠道特异性标记物，cdx2和villin一般联合应用，如果两者均为阴性，则可以基本排除肿瘤胃肠道来源的可能性，两者均为阳性，肿瘤很大可能起源于胃肠道，当cdx2强阳性而villin阴性时，可基本认定原发肿瘤是结肠，gcdfp15阳性提示乳腺原发肿瘤。
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