【摘要】 目的 研究pbk/topk在hu(羟基脲)诱导白血病细胞k562的分化时的表达及意义。方法 用不同浓度的羟基脲对k562细胞进行诱导分化实验，通过联苯胺、吉姆萨瑞氏染色和流式细胞仪证实其分化方向；用western blot法检测pbk/topk在k562细胞分化前后表达的变化。结果 400μmol/l的羟基脲对k562作用4d后具有良好的诱导分化效果，并诱导其向红系分化，且pbk/topk在k562细胞向成熟分化后表达不变，而phopbk/topk和phop38有少量增加。结论 hu能抑制白血病细胞k562的增殖,并诱导其向红系分化,在此过程中，有激活的pbk/topk参与，推测很可能通过磷酸化下游分子p38而起作用。
【关键词】 k562细胞 pbk/topk 细胞分化 羟基脲
白血病是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，我们对它的治疗主要采取传统的放化疗。近年来，人们陆续发现，在一些药物的诱导作用下，肿瘤细胞可以向成熟方向发生分化，有的出现类似正常组织细胞的表型，有的甚至还恢复了正常细胞的某些功能。这为抗肿瘤治疗开辟了一条新途径。本实验中我们建立了hu诱导的k562向红系分化模型，研究pbk/topk信号转导分子在分化机制中的作用。
1 材料和方法
1.1 材料
人急性髓细胞白血病细胞株购自美国atcc公司，由本室保存。wWW.11665.compbk/topk和phopbk/topk（均为兔抗人多克隆抗体），phop38（兔抗人单克隆抗体）为美国cellsignal technology公司产品，羟基脲(hu)购自sigma公司，新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司,联苯胺为promega公司产品,western blot检测试剂盒购自德国boehringer mannheim公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养将培养至对数增殖期k562细胞分3组(2组用于制备分化模型，1组用于对照)，每组细胞5×104，分别接种于含10胎牛血清的rpmi
图1 诱导分化前的k562细胞（×200） 图2 诱导分化后的k562细胞（×200）
1640培养液中，于37℃、饱和湿度、5% co2孵箱培养。
1.2.2 k562细胞向红细胞系分化模型的制备 分别按照文献[1]方法复制k562细胞向红细胞系分化模型，即用hu 200μmol／l和400μmol／l分别诱导k562细胞4d，对照组细胞仅加入相应体积rpmi 1640培养液。每天记录细胞数。
1.2.3 k562细胞红系分化的检测 利用常规联苯胺染色、吉姆萨瑞氏染色、流式细胞仪等方法证实k562细胞分化方向。
1.2.4 western blot法检测pbk/topk、phopbk/topk和phop38表达变化 诱导k562细胞4d后，分别收集各实验组及对照组细胞，冷pbs洗涤细胞2次，离心(1000 g×5min)，弃上清，提取各组细胞总蛋白质，用紫外分光光度仪进行蛋白质定量，并将各组蛋白质浓度稀释为1μg／μl，按western blot检测试剂盒说明检测各实验组及对照组k562细胞pbk/topk蛋白表达情况。简述步骤如下：各组总蛋白进行80g／l sds聚丙烯酰胺凝胺电泳(page)，电泳带转印至pvd膜将膜浸入5%脱脂奶粉封闭1h，加入1∶800稀释的pbk/topk、phopbk/topk和phop38 (4℃，过夜)，tbst洗膜，生物素化的羊抗兔igg二抗37℃温育1h，tbst洗膜后dab显色至条带清晰。pbk/topk、phopbk/topk和phop38相对分子量为43kd。
1.3 统计学方法
以上实验均重复3次，数据采用spss 10．0统计软件分析。率的比较用χ2检验。
2 结果
2.1 hu诱导的k562细胞形态学改变
对照组k562细胞胞体较大,大小不等，圆形，周围有许多不规则瘤状突起，胞核大，染色质疏松，核仁清晰易见。400μmol/l hu诱导细胞4d后,k562细胞体积减小,核浆比例减低，核仁变的模糊甚至消失,核染色质由疏松趋向致密，核形态扭曲折迭或分叶，胞质趋向成熟改变（见图1、2）。
2.2 联苯胺染色阳性率的变化
以不加任何处理因素的k562细胞作为对照组， 进行联苯胺染色细胞内含血红蛋白时， 联苯胺染色着蓝色为联苯胺阳性细胞， 不着色为阴性细胞， 光镜下计数200个细胞， 计算联苯胺阳性细胞。 400μmol/l hu诱导k562细胞4d后, 联苯胺染色阳性细胞数增至（39.12±4.87）%与k562单独培养对照组(5.75±1.23)%相比明显升高(p＜0.05)。
2.3 细胞周期的改变
流式细胞仪检测结果显示，k562细胞在400μmol/l的hu作用下，发生g0/g1期阻滞。g0/g1期细胞由对照组的58.3％（见图3） 增加到的82.5％(p<0．05)（见图4）。
2.4 western blot方法检测k562细胞向红系分化时pbk/topk、phopbk/topk和phop38表达情况
诱导k562细胞4d后，提取各组细胞总蛋白，western blot检测发现，对照组和400μmol/l hu诱导k562细胞向红系分化时，pbk/topk表达无明显差异,而phopbk/topk和phop38表达少量增加(见图5)。
3 讨论
k562细胞是来自慢性粒细胞白血病急性变的
图5 k562细胞向红系分化前后蛋白的表达变化
细胞系， 在不同诱导因素作用下可向巨核系、 红系或单核/巨噬系统分化， 提示k562细胞可能是异常的造血祖细胞。 我们通过细胞瑞氏吉姆萨、 联苯胺染色， 细胞周期分析证实了羟基脲可诱导k562细胞向红系分化。 我们知道， 丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase， mapk)包含3个成员： erk（extracellular signalregulated）、 jnk（jun nterminal kinase）及p38mapk ， 在肿瘤细胞的分化和凋亡中起调控作用， 多种药物通过激活或抑制mapks信号转导系统来调节肿瘤细胞的分化和凋亡过程[2]。 而pbk/topk是mapkk家族新的成员， 系统进化树显示它是mek1/2和mkk7之间的分支。 pbk/topk是一种丝/苏氨酸激酶， 在有丝分裂期间活化及磷酸化[3]。 它由激酶的亚结构域和1个碳末端的锌指结构结合域组成， 被认为和肿瘤抑制因子hdig相互作用， 最早发现在burkitt淋巴瘤高表达。 造血系统恶性肿瘤的pbk/topk的强表达与磷酸化的cmyc的高表达密切相关， 说明pbk/topk参与了细胞的恶性增殖[4]。 侵袭性淋巴瘤中pbk/topk的表达显著高于惰性淋巴瘤也表明了pbk/topk和细胞的恶性增殖密切相关[5]。 pbk/topk的活性在终末分化的hl60细胞中显著减低， 表明pbk/topk可以作为血液肿瘤细胞分化的指标之一。 长期以来， 我们对mapk通路在k562分化时的细胞信号转导机制尚不清楚， 体外的研究已经表明p38map激酶是pbk/topk激酶活性的一种底物， pbk/topk可以使p38mapk磷酸化， 但并不磷酸化erki/2或jnk[6]。 研究表明在hl60细胞分化末期， 甚至在pbk/topk表达缺失时， p38仍保持在恒定水平， 可见pbk/topk信号的磷酸化与p38 水平高低的联系还存在其他相关细胞因子调节。 在hl60细胞内pbk/topk和p38的变化， 可能是其他的mapk激酶上调激酶（如mkk3 和 mkk6）在保持磷酸化p38的水平过程起到了重要作用[7]。
实验证实，在tpa诱导的hi60细胞向粒系分化过程中，pbk/topk表达量减少，这和国外文献报道一致，但磷酸化的pbk/topk少量增加[8]。本次实验又得出pbk/topk在k562细胞分化前后表达没有差异，但它的活化形式phopbk/topk在分化后表达含量增加，同时，磷酸化p38的表达含量也增加，说明在血液系统恶性肿瘤中，pbk/topk水平与白血病细胞的分化及生长俘获存在不确定关系。hu诱导的k562细胞向红系分化仍处于较早期水平，还未分化到终末期的成熟细胞水平；pbk/topk在信号转导过程中的作用依细胞类型而定，激活的pbk/topk对hu诱导的k562细胞向红系分化起一定作用，很可能通过下游分子p38磷酸化来实现。磷酸化的pbk/topk和磷酸化的p38少量增加提示在白血病分化的复杂过程中，可能存在多种相关因子的调节，或者还有其他的分化途径，致使pbk/topk的表达呈相反的现象。本研究为今后临床治疗白血病提供了有价值的策略和线索。
【参考文献】
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