作者：赖日勇，李小波，许春鹃，叶金花
【摘要】 目的研究羟基喜树碱对人胰腺癌panc-1细胞生长的抑制作用及其作用机制。方法mtt法测定羟基喜树碱对panc-1细胞生长的抑制作用；流式细胞仪检测羟基喜树碱对panc-1细胞周期、凋亡率和caspase-3活性的影响。结果羟基喜树碱能抑制panc-1细胞生长，并呈剂量依赖关系，其半数抑制浓度(ic50)为51.52 μg/ml；流式细胞仪检测显示低浓度羟基喜树碱处理后可将细胞先后阻滞于s 期和g2/m 期，高浓度的羟基喜树碱则诱导细胞凋亡；细胞凋亡率和caspase-3活性随药物浓度升高和处理时间延长而逐渐递增。结论羟基喜树碱能抑制人胰腺癌panc-1细胞的生长，其抗肿瘤作用机制与阻断细胞周期、诱导细胞凋亡和激活caspase-3活性有关。
【关键词】 羟基喜树碱 人胰腺癌细胞panc-1 抗肿瘤作用
羟基喜树碱（hydroxycamptothecin, hcpt）是从我国珙桐科植物喜树中分离出的20多个单体中抗癌作用最强的微量植物碱，是一种dna拓扑异构酶i（dna topoisomerase i, dna topoi）抑制剂。www.11665.coM大量的临床研究证明，羟基喜树碱具有抗肿瘤作用强和毒性低的优点，具有广谱抗肿瘤作用，对多种肿瘤细胞株及移植瘤有较高的抑制率［1］。目前羟基喜树碱对胰腺癌的 治疗 研究很少［2］，为此本文研究了羟基喜树碱对胰腺癌细胞panc-1的抑制作用及其作用机制，以期为临床应用提供理论基础和依据。
1 材料与仪器
1.1 细胞系人胰腺癌细胞panc-1由日本大阪大学消化器一般外科赠送。
1.2 药品与仪器羟基喜树碱针剂（贵州汉方制药有限公司提供，批号20030403）；噻唑蓝（mtt）、dmem高糖培养基（gibco公司产品）；二甲基亚砜(dmso，上海生物工程有限公司产品) ；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司产品）；细胞周期测定试剂盒、caspase-3活性测定试剂盒、流式细胞仪（bection dikinson公司产品）； co2培养箱（forma公司产品）；multiskan mk3酶标仪(thermo labsystems公司产品)。
2 方法
2.1 细胞培养将panc-1细胞接种于含10％灭活新生牛血清的dmem高糖培养液中（不含抗生素），在37℃、5％co2、饱和湿度下培养。3 d传代1次，隔天换液1次，取对数生长期的细胞进行实验，分别用各种浓度的羟基喜树碱处理细胞，未加药组为对照组。
2.2 细胞生长抑制率的测定采用噻唑蓝还原法进行检测。取对数生长期的panc-1细胞接种于96孔培养板中(密度为1×104/孔)，每组设6个平行孔。加入用dmem高糖培养液稀释的不同浓度羟基喜树碱(6.25，12.5，25，50，100，200，400 μg/ml)分别培养，以未加羟基喜树碱为对照组。加药培养48 h后每孔加入mtt(5 mg/ml)20 μl，37 ℃继续培养4 h后，离心后吸去上清液，每孔加入dmso 100 μl，振荡10 min使结晶充分溶解,酶标仪570 nm 波长检测各孔吸光度(a值), 计算 细胞生长抑制率及半数抑制浓度（ic50）值。细胞生长抑制率（%）=(1-实验组平均a值/对照组平均a值) ×100%。
2.3 细胞周期及凋亡率测定收集不同浓度羟基喜树碱(0，6.25，25，100μg/ml)处理24、48和72 h后的panc-1细胞，预冷的pbs洗涤细胞两次，预冷的70%乙醇固定过夜。2 000 r/min离心10 min，弃去乙醇，再次悬浮于预冷的pbs，细胞经溴化丙啶(pi，10 μg/ml)染色5 min，4℃避光30 min后，上流式细胞仪，激发光波长为488 nm，吸收波长610 nm。检测细胞dna水平，根据dna水平在流式细胞仪中得出每份样品的g0/g1，s和g2/m期细胞分布图。ly-sis软件(becton dickinson公司产品)分析。
2.4 细胞caspase-3活性（相对荧光值）测定收集不同浓度羟基喜树碱(0，6.25，25，100 μg/ml)处理24，48和72 h后的panc-1细胞，预冷的pbs洗涤细胞2次，预冷的70%乙醇固定过夜。2 000 r/min离心10 min，弃去乙醇，再次悬浮于预冷的pbs，按caspase-3活性测定试剂盒说明书进行操作,上流式细胞仪测定caspase-3活性（相对荧光值）。
2.5 统计学分析采用统计软件spss 14.0进行数据处理。
3 结果
3.1 羟基喜树碱对panc-1细胞生长抑制率的测定结果见图1。羟基喜树碱能有效抑制panc-1细胞生长，6.25，12.5，25，50，100，200及400 μg/ml羟基喜树碱对panc-1细胞的生长抑制率分别为(9.9±5.2)%、(20±5.7)%、(35.8±6.9)%、(46.5±2.1)%、(65.6±3.4)%、(78.7±1.5)%、(89±1.6)%，其抑制作用呈浓度依赖性，半数抑制浓度（ic50）为51.52 μg/ml，95%可信区间为(43.19～61.49) μg/ml。
3.2 羟基喜树碱对panc-1细胞周期及细胞凋亡的影响panc-1细胞分别经6.25，25和100 μg/ml 羟基喜树碱作用后，细胞周期和凋亡率产生了明显的变化（见表1）。与对照组比较，低浓度的羟基喜树碱（6.25 μg/ml）处理后g0/g1期比率明显下降，s期和g2/m期比率明显上升，未出现明显细胞凋亡；25μg/ml组s期比率上升，g2/m期比率明显下降，处理48 h出现明显细胞凋亡；100 μg/ml组g0/g1期比率上升，g2/m期比率下降，细胞凋亡为主；细胞凋亡率随着羟基喜树碱浓度升高和处理时间延长而明显上升。
3.3 羟基喜树碱对panc-1细胞caspase-3活性的影响结果见图2。与对照组比较，羟基喜树碱处理组panc-1细胞caspase-3活性明显上升(p<0.05)，且随着羟基喜树碱浓度的升高和处理时间的延长而逐渐递增。表1 羟基喜树碱对panc-1细胞周期和凋亡率的影响（略）
4 讨论
胰腺癌是恶性程度最高的致死性肿瘤之一，多数胰腺癌患者明确诊断时已属中晚期，由于其侵袭性强，诊断后中位生存期不到6个月，预后很差，但是目前胰腺癌临床化疗效果并不令人满意［3］。本研究结果表明羟基喜树碱对胰腺癌细胞panc-1有较强的生长抑制作用，应是治疗胰腺癌较好的化疗药。
羟基喜树碱是细胞周期特异性药物，主要作用于s 期，并对g2/m 期边界有延缓作用；它能够抑制dna 拓扑异构酶ⅰ将dna 断端重新接合的正常功能，并进一步造成dna 链的断裂损伤，从而抑制dna的复制，阻断rna的合成（即转录）、干扰细胞分裂周期（延迟g2 期），最终导致肿瘤细胞死亡［4，5］。goldwasser等［6］的研究显示，低浓度羟基喜树碱作用人结肠癌细胞sw620后可阻断细胞周期于g2/m 期，但高浓度的羟基喜树碱则阻滞于s 期。与该研究相似，本研究显示胰腺癌细胞panc-1在低浓度羟基喜树碱作用下，细胞周期被先后阻滞于s 期和g2/m 期，当羟基喜树碱为25μg/ml时，则阻滞于s 期，该结果说明低浓度羟基喜树碱造成dna 损伤及抑制dna 复制的强度有限，因此，部分细胞仍可进入g2/m 期，同时由于羟基喜树碱具有干扰细胞分裂周期的功能，故可将这部分细胞阻断在g2/m 期，但当羟基喜树碱浓度进一步升高时对dna 的损伤作用增强，则细胞被完全阻断在s 期。许多研究还显示羟基喜树碱可诱导肿瘤细胞凋亡［7，8］，本研究也显示在较高浓度时，羟基喜树碱先将细胞周期阻滞于s期，然后诱导细胞凋亡，细胞凋亡率随着羟基喜树碱浓度升高和处理时间的延长而明显上升。
细胞凋亡的分子机制研究表明，凋亡是多基因参与的级联反应过程。caspase-3 是凋亡的执行器之一，多种刺激因子通过触发凋亡的信号转导途径，激活启动子caspase 8、9、10，最终触发效应器caspase3、6、7［9～11］。本研究中，细胞凋亡率随着羟基喜树碱浓度升高和处理时间的延长明显上升，而细胞caspase-3活性也随着羟基喜树碱浓度升高和处理时间的延长逐渐递增，因此证明羟基喜树碱依赖caspase-3途径诱导panc-1细胞凋亡。
综上所述，羟基喜树碱对panc-1细胞具有明显的生长抑制作用，其作用机制可能是通过抑制dna 拓扑异构酶ⅰ，导致dna 的损伤，从而干扰细胞周期（阻滞于s 期及g2/m 期）以及依赖caspase-3途径诱导细胞凋亡，最终导致panc-1细胞死亡。
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