【摘要】 目的 探讨stat3在喉癌组织中的表达及意义。方法 采用免疫组织化学法和rt－pcr 检测stat3蛋白及 mrna 在喉癌组织中的表达情况。结果 免疫组织化学检测发现30例喉癌组织标本中有23例stat3高表达,而8例正常组织中有2例低表达（p<0.05）,6例未表达；rtpcr检测stat3 mrna的表达结果显示30例喉癌组织中21例呈高表达,相应的正常组织2例为低表达（p<0.05）。结论 stat3高表达于大多数喉癌组织中,较正常组织表达明显升高，提示stat3的表达可能与喉癌的发生、发展密切相关。
【关键词】 stat3 喉肿瘤 基因表达
stat3是在研究ifn信号转导机制的过程中发现的一种转录因子,可以在外界信号的刺激下激活并直接转入细胞核内引发相应靶基因的转录,是一种信号转导子和转录激活子(signal transducers and activators of transcription, stat)[1]。近年来研究发现, stat3具有强烈抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的作用,参与了人类恶性肿瘤的发生、发展和演进[2]。本研究采用rt－pcr和免疫组织化学的方法检测stat3在喉癌组织中的表达，探讨其在喉癌发生发展中的作用。
1 资料与方法
1.1 资料来源
标本取自2003年1月～2004年7月华中科技大学同济医学院附属协和医院耳鼻喉科手术切除的喉癌组织标本，共30例。wWw.11665.com所有病例均是首次手术，术前均未行放、化疗，术后均经病理检查诊断为喉鳞状细胞癌。其中男26例,女4例;年龄49～74岁,平均59.6岁。另选8例正常喉黏膜组织标本为对照组。所取组织标本分为2份,一份石蜡包埋,用于免疫化学检测;另一份半小时内储存于-70℃深低温冰箱用于rtpcr检测。
1．2 主要试剂
trizol 购自美国invitrogen公司，逆转录试剂盒及taqdna聚合酶均购于美国fermentas公司。兔抗人stat3单克隆抗体购自美国santa cruz公司；sp免疫组化试剂盒购自北京中杉生物工程有限公司。hep2细胞系来源于人喉鳞状细胞癌，购于武汉中国典型培养物保藏中心（ctcc）。
1. 3 免疫组织化学染色
链霉素抗生物素蛋白过氧化酶法(sp)检测喉癌组织中stat3的表达：采用sp染色试剂盒,染色方法严格参照其说明书进行。使用微波抗原热修复,抗原修复液为ph 6.0的枸橼酸缓冲液, pbs缓冲液代替一抗作阴性对照，抗体工作浓度为1∶100，经dab 显色,苏木精对比染色后,中性树胶封片。stat3染色结果的判断：胞浆或胞核呈棕黄色为阳性。
1．4 rtpcr
取存放于-70℃冰箱的喉癌组织以及正常喉组织各约50 mg左右，同时取经过复苏培养的喉鳞癌细胞株hep2 10μl,匀浆后加trizol试剂0.6ml,同样按trizol试剂使用说明抽提总rna。使用逆转录试剂盒逆转录酶合成cdna 链。pcr引物序列由应用软件primer 5.0设计,然后由上海生工公司合成。stat3:5′gtcagatgccaaatgc 3′（上游）; 5′cctggaggcttagtgc3′ （下游）,长度为409bp。βactin： 5′tgtacgttgctatccaggct3’ （上游），5′ctccttaatgtcacgcacga3’ （下游），长度为248bp。pcr反应体系(总体积25μl): h2o 16μl, 10mmol/ l dntp 1μl, 25mmol/l mgcl2 2μl, 10×buffer 2.5μl、上,下游引物各0.5μl, cdna 2μl, taq酶0.5μl。pcr 条件: 预变性94℃ 5min; 94℃ 45s;53℃ 45s; 72℃ 1min; 36个循环; 延伸72℃ 10min。反应结束后取5μl 产物用1.5%琼脂糖凝胶(内含嗅化乙啶) 电泳,紫外灯下观察并用凝胶成像系统成像。
1．5 stat3染色结果的判断
胞浆或胞核呈棕黄色为阳性，在不同位置取10个高倍视野（×200），记录每个视野100个细胞中阳性染色细胞个数，计算阳性百分率取平均值。肿瘤细胞着色率0～5％为“-”；肿瘤细胞着色率≥6％为“+”。
1．6 统计学处理
所有数据应用spss10.0软件进行统计学处理，根据实验资料要求，选用独立样本的t检验进行数据分析，以p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 stat3在喉癌和正常喉组织中的表达
stat3蛋白阳性信号主要位于细胞浆中,少数位于细胞核。 喉癌组织中stat3蛋白的阳性表达率为76.7%(23/30),正常喉组织中阳性率为25.0%(2/8),两组之间差异有统计学意义(p<0.05)，见图1、2。
2.2 stat3mrna在喉癌和正常喉组织中的表达
30例喉癌组织标本中21例(70.0%) stat3 mrna呈阳性表达,8例正常组织2例为阳性（25.0%）表达。两组之间差异有统计学意义(p<0.05)。hep2细胞中stat3mrna也为阳性表达，见图3。
3 讨论
stat3是一种主要位于细胞浆中与酪氨酸磷酸化信号通道耦联的双功能蛋白，已被定义为癌基因[2]。stat3是在1994年作为白细胞介素6(il6)信号传递中的急性期反应因子被纯化的[1]。编码stat3的基因在人类定位于第12号染色体(q13至q141)。外源细胞因子通过jak/stat途径激活stat3而诱导目的基因表达[3]。活化stat3的细胞外信号为细胞因子如il6、il11、抑瘤素m（osm）、睫状神经营养因子（cntf）等；生长因子如表皮生长因子（egf）、血小板衍生生长因子（pdgf）、转化生长因子（tgf）等；细胞因子通过jak/stat途径,激活stat3而诱导目的基因表达。细胞因子与细胞表面的受体结合,受体分子发生二聚化,使得与受体耦联的jak激酶(janus kinase)相互接近并通过交互的酪氨酸磷酸化作用而活化,激活受体酪氨酸激酶,受体的tyr残基也发生磷酸化,形成相应的stat3蛋白与受体复合物结合的“停泊位点”。stat3通过其sh2结构域与受体上的磷酸化tyr残基结合,并在jak激酶的作用下,其ｃ端tyr残基发生磷酸化。两个磷酸化stat3分子通过ｓｈ2结构域相互作用形成二聚体,离开受体进入细胞核,与目的基因的启动子区域结合,有些可能再经过某种修饰作用(如scr的磷酸化)诱导基因表达。stat3作用结束后,通过核内酪氨酸磷酸酶的去磷酸作用,stat3蛋白去磷酸进入胞质,或通过蛋白水解酶降解stat3蛋白。生长因子含有内源性酪氨酸激酶的受体如表皮生长因子受体（egfr）,能自动磷酸化受体胞质部分,与stat3蛋白结合,激活stat3蛋白。另外,肿瘤源性非受体酪氨酸激酶,如ｖscr、bcrabｌ,可不通过受体,直接磷酸化stat3。stat3对于上皮细胞的凋亡,后哺乳期乳腺的发育,皮肤的重建,巨噬细胞的失活和th细胞反应中的炎性因子下调具有重要的调控作用[4]。最近研究表明，stat3是egf、il26/jak、src等多个酪氨酸激酶信号通道汇聚的焦点[5,6],在多种肿瘤中包括乳腺癌、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、脑瘤、非小细胞肺癌和各种白血病等都有过度激活[5]。
本研究结果显示喉鳞状细胞癌中,在蛋白质水平，stat3 蛋白的阳性表达率为76.7%,显著高于相应正常组织表达,在核酸水平，70.0%喉癌组织mrna呈阳性表达，显著高于相应正常组织表达。这与国外学者grandis报导头颈部鳞状细胞癌中stat3过表达结果基本一致[7]。本研究中蛋白的阳性表达（23例）略高于mrna的表达（21例），推测其中2例肿瘤标本从取材到rna提取时间过长，导致rna降解，在统计学上对结果没有影响。stat3蛋白的过度表达可能通过上调编码凋亡抑制剂和细胞周期调节剂如bclxl、mcl1、cyclinsd1/d2和cmyc等的基因表达参与肿瘤的发生发展[8]。
在正常鼠成纤维细胞及人口腔角化细胞、乳腺细胞中阻断stat3信号通道并不影响细胞生长[9], 因此, 阻断stat3途径也许不会过多损伤正常细胞的功能。在头颈部鳞癌中，体外试验表明减低stat3表达可有效抑制肿瘤细胞生长[10]。这说明stat3可能成为肿瘤治疗中一个新的具有广阔前景的治疗靶点。本研究为在喉癌中以stat3作为靶点的基因治疗提供了理论基础和实验依据。
【参考文献】
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