【摘要】 目的 研究胃癌细胞系中dpc4基因表达和启动子区域的突变情况，并分析了两者之间的关系。方法 采用rt²pcr法检测9种胃癌细胞系中dpc4基因的表达情况；克隆和测序dpc4启动子区域的突变情况；应用tfsearch ver.1.3软件分析dpc4启动子区域的转录因子结合位点。结果 dpc4在snu5、snu16、snu484、snu638和katoⅲ细胞中表达较高，而在snu216、mkn28、mkn74 和 ags细胞中表达较低或缺失。测序结果表明，mkn74细胞dpc4启动子区域出现了两处碱基置换突变，而在其它8种细胞系中没有发现突变。两处突变可能会影响转录因子mzf²1和ik²2与dpc4启动子的结合。结论 dpc4基因在胃癌中频繁发生失活，而其启动子区域的突变可能是导致其失活的原因之一。
【关键词】 dpc4 胃癌 启动子 突变
0 引言
胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居消化道肿瘤的首位[1]。目前，随着分子病理学的发展，许多基因，如tp53、k²ras、c²erbb2、k²sam、e²cadherin (cdh1)和pten，已被发现与胃癌的发生和发展过程密切相关[2²3]。Www.11665.CoM然而，研究表明这些基因的改变并不能完全说明胃癌的演进过程，与胃癌相关的且未被阐明的分子事件还很多。最近，有文献报道，位于18号染色体的dpc4（deleted in pancreatic carcinoma 4,dpc4）基因可能在胃癌的发生发展过程中扮演着非常重要的角色[4]。
dpc4基因所编码的蛋白（smad4）是tgf²β（transforming growth factor²β，tgf²β）信号通路中的一个重要的成员。smad4蛋白在细胞浆内与磷酸化的受体型smad蛋白, 即smad2 和 smad3，形成异源三聚体复合物，然后从胞浆穿梭入细胞核。此复合物在细胞核内作为转录因子调节tgf²β靶基因的表达，其中包括细胞周期蛋白依赖的激酶抑制基因（cyclin²dependent kinase inhibitors）p15 (ink4b) 和 p21 (waf1)[5²6]，从而抑制了细胞周期的进程。因此，当dpc4失活或表达下调时就会促进肿瘤的发生和发展。本课题组前期实验结果表明dpc4基因的失活与胃癌密切相关，且其失活可能是由多种因素共同作用的结果[7]。zhou等[8]报道dpc4基因启动子区域的突变可能是导致dpc4在子宫内膜癌中失活的原因之一，然而对于胃癌细胞中是否存在dpc4启动子区域的突变至今还未见报道，为此，我们研究了9种胃癌细胞系中dpc4基因启动子区域的突变情况，并分析了dpc4突变与基因表达之间的关系。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
在所研究的9种胃癌细胞系中包括6种低分化的细胞系（snu5、snu16、snu216、snu484、snu638、ags）、2种中等分化的细胞系（mkn28和mkn74）和一种印戒细胞癌的细胞系（katoⅲ），所有细胞均由韩国首尔大学药学院申英基教授馈赠。snu5和snu16 细胞为悬浮生长的细胞系，其余为贴壁生长的细胞系。细胞接种在含10%胎牛血清、2mm谷氨酰胺、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的rpmi²1640培养液中，在37℃，5% co2环境下培养。
1.2 核酸提取
采用基因组dna提取试剂盒（qiagen, germany）来提取9种传接5代以内的细胞系基因组dna，所有的操作步骤完全参照试剂盒说明书的进行。提取的dna首先要经过琼脂糖凝胶电泳来检测是否有降解成分，合格的再经过紫外分光光度计检测其含量和质量，od值260nm/280nm在1.8到2.0之间的为质量合格。此外，我们用trizol（invitrogen, usa）试剂从细胞系中提取rna，然后利用superscriptⅱ转录酶、寡核苷酸²dt以及随机引物与rna共孵育来进行反转录。整个操作过程完全按照产品说明书执行。
1.3 反转录聚合酶链反应 (reverse transcription pcr, rt²pcr)
采用rt²pcr的方法来检测9种胃癌细胞系中dpc4基因在rna水平的表达情况。具体的引物序列如下：正义引物5′²atg gac aat atg tct att a²3′，反义引物5′²gtc taa agg ttg tgg gtc²3′，其扩增片断为dpc4基因编码区cdna的全长。pcr反应的条件是：94℃变性5min，紧接着28个循环的94℃变性30sec，60℃退火45sec和72℃延伸90sec，最后是72℃10min延伸步骤。pcr反应混合物的成分包括：1×缓冲液，1.5mm mgcl2，10pmol双向引物，0.2mm dntp，1u taqdna聚合酶，cdna和相应的双蒸水，反应混合物的总体积为50μl，阴性对照为无模版的pcr反应。最后利用浓度为1%的琼脂糖凝胶（溴化乙锭染色）对pcr产物进行电泳。所获得的凝胶图像用alaphaimager 2200凝胶分析软件进行分析。
1.4 pcr扩增和测序
为了检测胃癌细胞中dpc4基因启动子区的突变情况，我们对9种胃癌细胞系的该区域进行了pcr扩增。具体的引物序列如下：正义引物5′²cca ggg gta aga gaa cac ca²3′，反义引物5′²gac atg gcg cgg tta cct²3′，其扩增片断长度为1438bp。pcr反应的条件是：94℃变性5min，紧接着40个循环的94℃变性30sec，60℃退火45sec和72℃延伸60sec，最后是72℃10min延伸步骤。pcr反应混合物的成分同上，模板为100ng 基因组dna，反应混合物的总体积为50μl。扩增产物首先经过1%琼脂糖凝胶电泳来检测是否有正确条带产生，然后利用试剂盒纯化扩增产物，再将产物克隆到pgemt质粒，提取质粒后，送到公司进行测序。
2 结果
2.1 dpc4在胃癌细胞中的表达
我们运用rt²pcr的方法对9种胃癌细胞系中的dpc4表达水平进行了检测，gapdh基因作为内参。结果显示，dpc4在snu5、snu16、snu484、snu638和katoⅲ细胞中表达较高，而在snu216、mkn28、mkn74 和 ags细胞中表达较低或缺失，见图1。说明dpc4基因失活在胃癌中是一种频繁发生的分子事件。
图1 dpc4在胃癌细胞中的表达情况（略）
fig 1 expression of dpc4 in gastric cancer cells
2.2 胃癌细胞中dpc4启动子区域的突变情况
为了阐明dpc4在胃癌细胞中的下调机制，我们应用pcr扩增及测序的方法对9种胃癌细胞系中的dpc4启动子区的突变状态进行了检测。pcr结果显示在所有的9种细胞系中都出现了特异性的条带，这表明在启动子区域没有大片段的插入或缺失突变。测序结果表明，在mkn74细胞的启动子区域出现了两处碱基置换突变，突变位点一个在距离转录起始位点上游38bp处（正义链g→c 或反义链c→g）见图2a，另一个突变位点在转录起始位点上游481bp处（正义链t→c或反义链a→g）见图2b，而在其它8种细胞系中没有发现dpc4启动子区域突变。
↓:signify mutation point
图2 mkn74细胞中dpc4启动子区域的突变情况（略）
fig 2 promoter region mutation of dpc4 gene in mkn74 cell
2.3 dpc4启动子区域的分析
为了探讨这些置换突变的意义，我们又利用tfsearch ver.1.3（japan）等软件对dpc4启动子区域进行了分析。分析结果显示，在dpc4启动子区域含有多个转录因子结合位点，这包括aml²1a、maz、 sp1、lef²1、hnf²3、 mzf²1和ik²2，见图3，而在mkn74细胞的两个突变恰好发生在转录因子mzf²1和ik²2的结合位点上，这提示两个碱基置换突变可能通过干扰转录因子的结合而影响dpc4基因的转录。
3 讨论
dpc4基因是一种经典的肿瘤抑制基因，已有研究表明dpc4基因的失活与多种肿瘤的发生发展密切相关[9]，然而对其失活机制至今还没有被完全阐明。本课题组前期研究表明在胃癌中dpc4基因启动子区域的甲基化、染色体的杂合性缺失以及编码区突变都是导致其基因失活的原因之一，但这三种遗传和表观遗传的机制并不能完全解释dpc4基因在胃癌中的失活，因为仍有一些胃癌组织在没有发生上述三种现象的同时却发生了基因失活现象[7]，这提示还有其他的机制参与了dpc4基因的失活。
zhou 等［8］研究发现在子宫内膜癌中dpc4基因启动子区域出现了置换突变，且其突变导致dpc4基因的失活，这一研究结果促使我们去探讨是否在胃癌中也发生了类似的现象，即启动子区域的突变也是导致胃癌细胞dpc4基因失活的原因。我们首先对9种胃癌细胞系中的dpc4的表达水平进行了研究，rt²pcr结果显示dpc4基因在胃癌细胞中频繁发生缺失或表达下调，这一结果与之前的报道基本一致。随后，为了探讨其失活机制我们对dpc4基因启动子区域进行了克隆和测序。我们发现在9种细胞中只有一种，即mkn74，在dpc4启动子区域发生了突变，突变的类型为置换突变，突变点一个位于距离转录起始位点上游38bp处（正义链g→c 或翻译链c→g），另一个突变位点在转录起始位点上游481bp处（正义链t→c或反义链a→g），而在mkn74细胞中的dpc4基因恰好发生表达下调，这提示启动子区域的突变可能是导致mkn74失活的机制。
↓：signify mutation point；▼：signify transcription start site；ø: signify transcription factor binding site
图3 dpc4启动子区域分析（略）
fig 3 analysis of dpc4 promoter region
为了更深入的了解dpc4基因启动子区域突变与失活的关系，我们对启动子区域的转录因子结合位点进行了分析。结果显示，在dpc4启动子区域含有aml²1a、maz、sp1、lef²1、hnf²3、mzf²1和ik²2等多个转录因子结合位点，而两个置换突变恰好发生在mzf²1和ik²2两个转录因子的结合位点上。mzf²1是一种c2h2锌指蛋白转录因子，研究发现此分子可调节细胞增殖和分化，并参与肿瘤形成[10]。而转录因子ik²2被发现可调节淋巴细胞分化，并可转录激活胰岛素调节的氨基肽酶（irap）和胎盘亮氨酸氨基肽酶（p²lap）等基因[11]。因此，发生在两个位点的置换突变可能会影响转录因子mzf²1和ik²2与dpc4启动子的结合，继而干扰了转录因子的转录激活作用，最终导致dpc4基因的失活。
总之，本研究首次发现了胃癌细胞中存在着dpc4启动子区域的突变，且其突变可能是导致dpc4失活的原因之一。然而对于两个置换突变的真正意义还有待于进一步研究阐释。
【参考文献】
［1］ fuchs cs, mayer rj. gastric carcinoma [j]. n engl j med,1995, 333(1):32²41.
［2］ werner m,becker kf,keller g,et al. gastric adenocarcinoma: pathomorphology and molecular pathology [j]. j cancer res clin oncol,2001,127(4):207²216.
［3］ 刘芬,于皆平,邓全军,等.pten在胃癌细胞中的表达及其cpg岛甲基化状态的研究[j].肿瘤防治研究,2006,33(9):632²634.
［4］ powell sm,harper jc,hamilton sr,et al. inactivation of smad4 in gastric carcinomas[j]. cancer res,1997,57(19):4221²4224.
［5］ pardali k,kowanetz m,heldin ch,et al. smad pathway²specific transcriptional regulation of the cell cycle inhibitor p21(waf1/cip1) [j]. j cell physiol,2005,204(1):260²272.
［6］ levy l,hill cs. smad4 dependency defines two classes of transforming growth factor {beta} (tgf²{beta}) target genes and distinguishes tgf²{beta}²induced epithelial²mesenchymal transition from its antiproliferative and migratory responses[j]. mol cell biol,2005,25(18):8108²8125.
［7］ wang lh, kim sh, lee jh,et al.inactivation of smad4 tumor suppressor gene during gastric carcinoma progression [j].clin cancer res,2007,13(1):102²110.
［8］ zhou y,kato h,shan d,et al.involvement of mutations in the dpc4 promoter in endometrial carcinoma development[j].mol carcinog,1999,25(1):64²72.
［9］ schutte m,hruban rh,hedrick l,et al. dpc4 gene in various tumor types [j]. cancer res,1996,56(11):2527²2530.
