【摘要】 目的 检测结直肠癌组织中黑色素瘤抗原基因mage1、3和4的表达，探讨其在结直肠癌免疫治疗及作为免疫分子标志物的可行性。方法 采用rtpcr方法，检测65例结直肠癌组织和相应正常粘膜组织中mage1、3和4的mrna表达，并对pcr扩增产物进行dna测序验证。结果 65例结直肠癌组织标本中，53.8%（35/65)的患者至少表达一种mage基因。mage1、3、4 mrna表达率分别是18.5%(12/65)、33.9%(22/65)和20%(13/65)，表达任意两种或以上的mage基因的标本为27.7%(18/65)，而相应正常粘膜组织均未检测到上述基因的表达。dna测序结果表明rtpcr产物确为目的基因片段。mage基因表达与患者的年龄(除外mage1,p=0.011)、性别、cea、肿瘤大小和位置、组织分化程度、淋巴结转移、肿瘤浸润深度及tnm分期无关(p>0.05)。结论 结直肠癌中mage3可作为肿瘤疫苗的备选基因和免疫学检测的分子标志物，具有作为肿瘤免疫治疗特异性靶位的潜在价值，而mage1,4因表达率低限制了其应用价值。
【关键词】 黑色素瘤抗原基因 结直肠肿瘤 mrna表达
黑色素瘤抗原基因（melanoma antigen gene，mage）是首先从黑色素瘤中发现的一组肿瘤特异性抗原基因，主要表达于以黑色素瘤为主的恶性肿瘤组织中，现已证实在肝、胃、肺等恶性肿瘤中有较高的表达，而在正常组织（除睾丸和胎盘外）不表达[1]，其表达又与肿瘤的发生、发展及预后关系十分密切。WWw.11665.coM利用这一特点可作为肿瘤免疫治疗理想的靶抗原。应用mage基因编码的抗原肽对黑色素瘤及转移瘤的肿瘤免疫治疗的实验和临床研究正在进行，并已取得较好的疗效[2,3]。但mage基因在结直肠癌中表达的研究较少且结果不一。为了解mage基因在结直肠癌中的表达特点，我们采用rtpcr方法检测mage1、3和4在结直肠癌中表达状况，为研制结直肠癌特异性的肿瘤疫苗及开展以此为靶抗原的免疫治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 组织标本
65例结直肠癌组织及相应的正常粘膜组织标本，均取自2005年7月～11月在广西医科大学第一附属医院住院手术治疗的患者。男44例，女21例；年龄30～80岁，中位年龄55.0岁。其中，高中分化腺癌57例；粘液腺癌3例，复发2例；低分化癌2例，复发1例。肿瘤分期和分级根据术后病理结果按最新国际抗癌协会tnm分期[4]，who标准分级，其中ⅰ期8例，ⅱ期32例，ⅲ期16例，ⅳ9例；有淋巴结转移18例，无淋巴结转移47例。所有病例术前均未进行放化疗。标本采集：癌组织取癌灶周边无明显坏死的肿瘤组织，正常组织取自距病灶10cm以上的正常粘膜，组织大小约1cm×1cm×1cm。标本在手术切除后10min内放入液氮冻存，后转入－80℃冰箱保存。标本均经病理组织学检查证实。睾丸组织用作阳性对照。
1.2 方法
1.2.1 rna提取及逆转录
用trizol提取组织总rna，紫外分光光度计测od值，以od260/od280＝1.8～2.0为rna质量判断标准。逆转录反应体系含总rna 3μg，oligo(dt)18 0.5μg，10mmol/ldntp 2μl，rnase抑制剂20u，逆转录酶200u，总体积为20μl。逆转录完毕后70℃变性10min，冰上冷却后-20℃冰箱保存备用。以上所用器材均为rnase free。gapdh用作内参照。
1.2.2 mage1、mage3和mage4基因的扩增（25μl反应体系）
以1μl cdna为pcr扩增模板，加1.5μl mgcl2，2.5μl 10×buffer，1μl dntps ，1μl引物(包括mage、gapdh)，0.2μl taq 酶，16.8μl 灭菌水。各基因的引物[5]及反应条件见表1。反应完成后取5μl pcr产物，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，少量溴乙锭染色鉴定。于紫外透射仪上观察电泳结果。采用biorad凝胶图像分析系统摄片。表1 rtpcr引物序列和反应条件
1.2.3 mage1、mage3和mage4基因扩增产物dna的测序
随机选取三种mage基因的阳性pcr产物（各3例）进行纯化和序列测定。pcr产物纯化采用bioflux试剂盒，操作按说明进行。送上海捷瑞生物工程有限公司进行dna测序。
1.2.4 统计学方法
应用统计学软件spss10.0对数据进行pearson χ2 检验或fisher确切概率法检验,以p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同mage基因的表达
mage1、3和4三种基因在不同结直肠癌组织标本表达情况见表2。65例结直肠癌组织标本中mage mrna表达频率最高的是mage3，表达率为33.9%(22/65)，mage1和mage4分别是18.5%(12/65)和20%(13/65)。内参照gapdh在所有组织标本中均有稳定表达，且强度基本一致，证实逆转录产物cdna的完整性,见图1。dna测序证实扩增条带均为目的基因。所有正常粘膜组织中均未检测出上述mage基因中任何一种的表达。表2 结直肠癌组织mage1、3和4基因的阳性表达
2.2 mage基因表达与临床病理特征的关系
三种mage基因的表达与患者年龄(除外mage1，p=0.007)、性别、cea、肿瘤大小和位置、组织分化程度、淋巴结转移、浸润深度及tnm分期无关，结果见表3。
2.3 结直肠癌标本中mage基因表达的聚集性
65例癌组织中三种mage基因表达呈不均匀分布，部分癌组织基因表达呈聚集性。53.8%(35/65)的癌症患者至少表达一种抗原基因，其中mage1、3同时表达为12.3%(8/65)，mage1、4为10.7%(7/65)，mage3、4为9.2%(6/65)，三种同时表达9.2%(6/65)。
2.4 三种mage基因扩增产物dna的测序
dna测序表明三种mage基因的rtpcr产物与genebank数据库（mage1、3、4基因的登录号分别为nm_004988.3、nm_005362.3、nm_001011548.1）检索序列一致，证实所得目的基因的序列正确。
3 讨论
mage基因家族位于x染色体上，除睾丸和胎盘组织外，在正常组织中均不表达，但在肝、胃、肺等恶性肿瘤中表达，其编码的抗原肽可与mhc分子表3 mage基因表达与结直肠癌临床病理参数间的关系注：*为淋巴结阴性组与阳性组mage表达率比较的p值，#为淋巴结n1组与n2组比较的p值结合递呈到细胞表面，被t细胞识别，从而激活抗肿瘤免疫应答[1]。因此mage基因编码蛋白成为肿瘤免疫治疗的靶抗原，以此抗原为主组成的疫苗是目前肿瘤疫苗研究和应用的热点[2,3]。自1991年van der bruggen 等用基因转染技术首次在黑色素瘤细胞中分离出mage1基因以来，许多学者对不同mage基因在不同恶性肿瘤组织的表达进行了广泛研究，但有关mage基因在结直肠癌中表达的报道很少且各家报道的结果不一。scanlan等[6]在关于mage基因的综述中提出结直肠癌属于mage基因低表达的肿瘤(以不足30％的基因家族在一种肿瘤中的表达率>20%为标准)。park等[7]研究38例结直肠癌病例的结果显示，mage1未见一例表达，mage3和mage4阳性表达率分别为5.3%和16.7%，有36.3%的肿瘤标本至少表达一种基因，其表达与患者年龄、性别、肿瘤组织学分型、dukes分期及淋巴结转移无关(p>0.05)。本实验仅有mage1表达与年龄有关(p=0.011)，分析原因可能与本组病例老年患者偏少有关。gerhardt等[8]研究26例结直肠癌手术病例的癌组织及癌旁组织、手术切缘和8种细胞株的16种肿瘤抗原基因(主要为mage)的表达情况，认为85%的标本至少表达一种肿瘤抗原，其中mage1表达率为58%，而mage3未见表达。而li等[5]研究121例结直肠癌标本结果显示mage1、3和4的阳性表达率分别为11.6%、27.3%、22.3%。
本实验结果显示mage基因1、3和4的阳性表达率分别为18.5%、33.9%和20%，以mage3表达率较高，53.8%(35/65)的患者至少表达一种抗原基因，而表达与性别、cea值、肿瘤大小、位置、组织分化程度、淋巴结转移、肿瘤浸润深度、组织学分级及tnm分期无关，提示这些基因与肿瘤进展情况及恶性程度无关，这与文献报道的结果相似。相应正常结直肠粘膜组织均未检测到基因表达，证实了mage在结直肠癌中的特异性表达，并有理由认为mage编码抗原可能成为结直肠癌特异性免疫治疗的攻击靶点。同时分析结直肠癌组织相同基因研究结果，各家不一，我们认为原因可能有：①标本数不同或标本量太少不能说明整体情况；②pcr引物设计及技术条件的差异；③不同人种表达的hla分子类型不尽相同。
对mage基因表达的分析还发现，在所检测的65例标本中呈不均匀分布，表达任意两种mage基因的标本为27.7%(18/65)，三种同时表达9.2%(6/65)，呈聚集性表达，即表达一种mage家族基因的标本可同时表达其他一种或两种以上的同一家族基因。mage基因聚集性表达为使用多价疫苗、增强免疫反应提供了可能。本实验结果显示mage3在国人结直肠癌中较高表达而正常组织不表达。这种现象就使临床上有可能将其编码蛋白作为免疫源用于结直肠癌的肿瘤免疫治疗，而mage1和4因其较低的表达率限制了应用价值，与上述研究者的预期结果相吻合。同时我们还注意到在tnm分期ⅰ、ⅱ的早期病例即有较高的表达（mage1、3和4的表达率分别为22.5%、32.5%和25％），说明mage表达有可能是结直肠癌发生过程中的早期事件，检测mage基因表达有可能作为结直肠癌免疫学检测的分子标志物，并且具有作为免疫治疗、基因治疗特异性靶位的潜在价值。
mage基因在结直肠癌组织的确切表达机制和功能还没有完全研究清楚。dna甲基化是目前被广泛接受的关于mage基因表达与沉默的机制，特别是启动子区域cpg 岛甲基化的状态直接影响基因的转录失活和表达[9]。dna甲基化异常一般发生在肿瘤发生的早期阶段，而本实验结果并未显示mage基因的表达与肿瘤分期有关。因此，进一步深入研究结直肠癌组织中dna甲基化对其表达调控的影响也是今后我们要研究的课题。
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