【摘要】 目的 探讨重组腺病毒介导的sirna技术下调cmet表达对cmet过表达肝癌细胞在体外生长和成瘤性的影响。方法 用重组腺病毒介导的sirna技术下调cmet的表达；通过western blot检测蛋白质的表达水平；以mtt法和细胞计数法检测细胞的生长和增殖情况；以流式细胞术检测细胞周期变化情况；以软琼脂克隆形成实验考察细胞的克隆形成能力。结果 重组腺病毒介导的sirna可使hcclm3细胞cmet的表达量下调90%以上。下调cmet表达可使hcclm3细胞生长停留在g1/g0期，增殖速率下降30%以上；下调cmet表达可使hcclm3细胞克隆形成能力下降约78%（p<0.01）。结论 重组腺病毒介导的sirna下调cmet表达具潜在的肝癌基因治疗价值。
【关键词】 cmet rna干扰 重组腺病毒 肝癌
cmet属肝细胞生长因子受体，在多种肿瘤中过表达，与肿瘤的发生和恶化密切相关[1]。我们及其他学者的研究表明cmet在30%～50%的肝癌病例中过表达[24]，肝癌伴有高cmet表达的患者5年生存率明显低于肝癌伴有cmet少量表达者[4]。人为在肝细胞内过表达cmet会导致cmet的配体非依赖性激活和细胞转化[5]。
虽然不少实验表明cmet过表达与肝癌的发生密切相关，但下调cmet表达对肝癌细胞生长有何影响尚不明确。www.11665.comrna干扰是最近几年发展起来的一项新兴的抑制基因表达技术，其本质是通过长度为19～21个核苷酸的小干扰rna（small interfering rna, sirna），介导序列高度同源的靶基因的mrna降解，从而在基因转录后水平上下调（knock down）靶基因的表达[6]。腺病毒载体因具有感染细胞种类多、感染效率高、外源基因表达水平高且既适于体外又适于体内研究等特点而被广泛用于肿瘤的基因治疗研究[7]。我们曾用western blot检测发现cmet在hcclm3肝癌细胞中高表达[2,3]。本文拟利用重组腺病毒介导的sirna技术考察下调cmet表达对肝癌细胞hcclm3在体外生长的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
穿梭质粒pshuttleh1由德国学者shen cx和reske sn惠赠，padeasy1腺病毒骨架质粒由美国学者he tc提供。胎牛血清为杭州四季青生物公司产品。核酸内切酶pacⅰ为neb公司产品。兔抗人cmet多克隆抗体为美国zymed公司产品。鼠抗人cyclin d1单克隆抗体为santa cruz公司产品。兔抗βactin多克隆抗体及ap标记羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。四甲基偶氮唑蓝（mtt）为sigma公司产品。
1.2 细胞培养
hcclm3肝癌细胞由上海肿瘤研究所惠赠，在37℃、含5% co2且湿度饱和的co2培养箱中用含10%胎牛血清的dmem培养基培养。
1.3 重组腺病毒载体的构建
从genbank中检索到cmet的cdna序列（登录号：nm_000245），用ambion公司网页上（/techlib/misc/ sirna_finder.html）提供的在线工具（sirna target finder）找出潜在的靶序列，再按sirna设计的一般原则选取靶序列。本实验选取的靶序列是5'aacatggctctagttgtcgac3'（正义），位于起始密码子下游349～369区。按照shen等[7]提供的方法将靶序列亚克隆进pshuttleh1产生pshuttleh1sirna/met，再参照he等[8]的方法将pshuttleh1sirna/met与病毒骨架质粒padeasy1在大肠杆菌bj5183中进行同源重组，提取重组病毒质粒，经pacⅰ酶切纯化后转染293a细胞包装出重组腺病毒adh1sirna/met，同时，用同样的方法以空载质粒pshuttleh1构建了重组空载腺病毒adh1null。
1.4 重组腺病毒对hcclm3细胞最适感染复数的测定
我们用表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒adcmv/gfp（本实验室贮存）来测定hcclm3细胞的最适感染复数（multiplicity of infection，moi）。hcclm3细胞接种于6孔板，生长至80%汇合度时，每孔分别加入已知病毒浓度的adcmv/gfp病毒液0.1、0.2、0.3、0.5、1和2μl。常规培养48h后，在倒置荧光显微镜下分别用可见光和荧光观察，统计表达gfp的细胞占总细胞数的百分比（感染效率），并根据孔内所加入的病毒数算出相应的moi。
1.5 western blot分析
细胞感染病毒72h后，吸去培养基，用冰预冷的pbs洗2遍，加入裂解缓冲液（50.0 mmol/l tris，150.0 mmol/l nacl，0.1% sds，1.0% np40，1.0 mmol/l na3vo4，2.0mmol/l naf，100.0 μg/ml pmsf，1.0 μg/ml leupeptin和1.0 μg/ml aprotinin），冰浴30min，刮取细胞，12 000g离心2min，收集上清。蛋白定量后，取50μg的总蛋白进行sdspage胶电泳分离，按常规方法转印至pvdf膜上，以3%的bsa封闭，一抗孵育过夜，用ap标记的二抗及nbt和bcip显色。
1.6 mtt法检测细胞活力
取对数生长期的细胞，消化制成单细胞悬液，计数后接种于96孔培养板，约0.5×104细胞/孔，设5个复孔。培养18h，分别加入不同moi的病毒溶液（对照孔设为不加病毒和加空载病毒）。继续培养72h，加入mtt至终浓度为0.5mg/ml，再培养4h后，终止反应，加入dmso溶解结晶，用elx 800（biorad公司）酶标仪于490nm处测od值。
1.7 细胞的生长曲线测定
取对数生长期的细胞，消化制成单细胞悬液，计数后接种于24孔培养板，约5.0×104细胞/孔，设3个复孔。培养18h，加入不同moi的病毒溶液（对照孔设为不加病毒和加空载病毒）。每隔24h消化计数，每次每组计数3孔，计算均值。共计数5d，以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制细胞生长曲线。
1.8 流式细胞术分析细胞周期
hcclm3细胞感染腺病毒3d或5d后（对照组设为不加病毒和加空载病毒），胰酶消化收集细胞，pbs洗2遍，用75%乙醇冰浴固定24h，然后用含1% bsa的pbs充分混匀洗涤2遍，重悬于pbs中，使细胞浓度达到1.0×106/ml左右，pi染色后进行流式细胞术分析。
1.9 软琼脂克隆形成实验 细胞感染腺病毒24h后，胰酶消化，梯度稀释，取2 000个细胞，接种于含底层6g/l琼脂糖和顶层4g/l琼脂糖的软琼脂的6孔板中，继续培养15d后，在倒置相差显微镜下观察，计数直径>50μm的克隆。
1.10 统计学方法
应用spss10.0统计软件进行单因素方差分析和差异显著性检验。
2 结果
2.1 重组腺病毒对hcclm3细胞的最适moi
为排除重组腺病毒本身对细胞的毒性作用，我们首先用表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒adcmv/gfp来测定hcclm3细胞的最适moi，见图1。随着感染复数的增加，感染效率不断上升，最终腺病毒对细胞的感染效率能达90%以上。实验时，取感染效率尽可能高而moi尽可能小，同时细胞没有明显的由病毒本身引起的细胞毒现象（变形或漂起）时的moi作为最适moi。本文将重组腺病毒对hcclm3细胞的最适moi定为150。
图1 重组腺病毒对hcclm3细胞最适moi的测定
2.2 adh1sirna/met对hcclm3细胞cmet表达的影响
为下调cmet的表达，我们构建了针对cmet的sirna表达重组腺病毒adh1sirna/met及空载腺病毒adh1null。western blot分析表明，随着moi的增加，adh1null不影响cmet表达，而adh1sirna/met对cmet表达的抑制作用逐渐增强。经光密度分析，当moi达150时，cmet表达量下降90%以上，见图2。图中cmet呈现两条带，较大的条带分子量为170kd，属cmet的前体形式；较小的条带分子量为140 kd，属成熟形式的cmet的β亚基[1]。
2.3 不同moi的adh1sirna/met对hcclm3细胞的活力影响
感染细胞3d后，空载腺病毒adh1null对hcclm3细胞的活力无明显影响，而腺病毒adh1sirna/met对hcclm3细胞的活力具有抑制作用，且随着moi的增加，抑制作用逐渐增强。当moi大于50时，抑制作用非常显著（p<0.01）。moi等于150时，腺病毒adh1sirna/met对hcclm3细胞活力的抑制率约为38%（p<0.01），见图3。
2.4 adh1sirna/met抑制hcclm3细胞增殖
细胞计数法显示，adh1null对hcclm3细胞的增殖无明显影响，而adh1sirna/met对hcclm3细胞增殖具有抑制作用。在adh1sirna/met感染hcclm3细胞的第3d、4d和5d，细胞增殖速率分别下降28%、35%和38%（p<0.01），见图4。
2.5 adh1sirna/met使hcclm3细胞停留于g0/g1期
为了解adh1sirna/met抑制hcclm3细胞生长与增殖的机制，我们用流式细胞术检测了adh1sirna/met感染细胞第3d和5d后hcclm3细胞周期的变化情况。感染病毒3d后，空白对照组和空载对照组的hcclm3细胞在g1/g0期细胞的比例分别为51.99%和54.16%，而实验组hcclm3细胞在g1/g0期比例则增至68.48%；实验组在s期细胞的比例仅为22.56%，明显低于空白对照组和空载对照组的37.11%和35.44%。随着感染病毒时间的延长，第5d后，实验组在g1/g0期细胞的比例进一步增加至84.98%，明显高于空白对照组和空载对照组的61.50%和64.94%；s期细胞的比例则进一步下降至12.12%，明显低于空白对照组和空载对照组的29.04%和25.21%。在第3d与第5d都没有检测到细胞凋亡。
2.6 adh1sirna/met明显抑制hcclm3细胞克隆形成
软琼脂克隆形成能力可在体外反映细胞的成瘤性，我们用此实验考察了adh1sirna/met对hcclm3细胞克隆形成能力的影响，见图5。空白对照组、空载对照组和实验组每个视野的克隆数分别为（79.4±10.7）、（73.0±9.9）和（16.0±8.7），adh1null对hcclm3细胞的克隆形成能力无明显影响，而adh1sirna/met使hcclm3细胞的克隆形成能力下降约78%（p<0.01）。
3 讨论
cmet与多种肿瘤发生密切相关，一直是令人关注的用于肿瘤基因治疗的靶基因。人们曾采取了多种策略来下调肿瘤细胞的cmet的表达以治疗肿瘤。abounader等[9]通过利用u1snrna核酶抑制cmet的表达而使恶性神经胶质细胞瘤表型反转、生长停滞或凋亡；herynk等[10]通过腺病毒载体介导的核酶下调cmet的表达并抑制了结肠癌在肝内的生长。在这些实验中，cmet的表达被下调了30%～90%不等。rna干扰技术具有高效、稳定且易操作的特点，shinomiya等[11]用腺病毒介导的sirna技术研究发现下调cmet表达可抑制多种肿瘤细胞在体外生长和体内成瘤，他们的结果表明腺病毒介导的sirna技术能使cmet表达量下降62%～100%，对不同的细胞下调效率不一样。他们的研究中没有肝癌细胞，我们的结果表明腺病毒介导的sirna技术能有效下调肝癌细胞cmet的表达，随着病毒感染复数的增加，cmet的表达可下调90%以上。herynk等[10]研究表明cmet表达量下降约30%就足以抑制结肠癌细胞在肝内成瘤。我们的体外实验表明adh1sirna/met可抑制肝癌细胞hcclm3生长，而且随着病毒感染复数的增加抑制作用逐渐增强，当病毒感染复数达50时，抑制作用非常显著，此时cmet表达量约下降50%。
癌基因的持久激活是肿瘤生长所必需的[12,13]。肿瘤细胞的癌基因失活后至少会出现三种可能情形：第一，肿瘤细胞可能会分化成正常细胞。shachaf 等[13]研究发现抑制肝癌细胞的myc基因表达后，一部分癌细胞分化成了肝细胞，一部分则转变成了肝干细胞；第二，由于大多数癌基因属有丝分裂原，它们的失活可能会导致肿瘤细胞的生长停滞；第三，肿瘤细胞可能会凋亡。我们的实验表明，腺病毒介导的sirna技术下调cmet表达可抑制肝癌细胞的生长，与第二种情形相一致。shinomiya等[11]报道用rnai技术抑制met表达可使多种肿瘤细胞凋亡。我们用流式细胞术未检测到adh1sirna/met感染后的hcclm3细胞凋亡，在显微镜下也未观察到细胞凋亡形态，我们又用tunel技术进行了检测，同样也未观察到凋亡的细胞，这可能与细胞类型不同有关。有报道[14]认为met与fas在细胞膜上直接接触，以复合体的形式存在，当met与fas分开后，细胞可能会因fasl/fas信号通路的激活而启动凋亡。我们以前的实验表明hcclm3细胞中没有fas表达[2]，因而从这一点讲下调cmet表达hcclm3细胞不发生凋亡也是可以理解的。
huh等[15]用条件性基因敲除的方法研究发现将cmet完全敲除后在正常生理条件下对肝细胞无致命影响。我们以前的研究表明[3]，腺病毒adh1sirna/met对正常肝细胞lo2的生长无明显影响，只能使cmet的表达量与lo2细胞相当的bel7402、smmc7721和hepg2细胞的生长速率下降8%～10%，但可使cmet高表达的mhcc97l细胞生长速率下降30%以上。本文的结果显示下调cmet的表达对hcclm3细胞在体外的生长和成瘤能力亦有显著的抑制作用，进一步表明腺病毒介导的sirna技术下调cmet表达可抑制cmet高表达的肝癌细胞生长，具潜在的肝癌基因治疗价值。
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