【摘要】 目的：探讨心肌缺血/再灌注过程中粉防己碱（tet）对核转录因子（nf）-κb的抑制因子（iκb-α）磷酸化及肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素-6(il-6)表达的影响以及机制。方法：60只sd大鼠被随机分为3组：缺血/再灌注损伤组（i/r）、假手术组、粉防己碱治疗组（tet）。i/r组结扎大鼠左前降支造成心肌缺血30 min后再灌注24 h，然后处死大鼠；假手术组只穿针不结扎，余步骤同i/r组；tet组在缺血前20 min腹腔注射tet，余步骤同i/r组。处死大鼠24 h后取心肌标本，用酶联免疫吸附法（elisa）检测心肌组织中tnf-α、il-6表达水平，应用免疫组织化学方法检测磷酸化iκb-α（p-iκb-α）的表达。结果：tet组与i/r组相比tnf-α、il-6表达水平明显减低［（208.40±25.12）pg/ml∶（306.65±17.78）pg/ml, (587.40±137.40）pg/ml∶（1003.75±138.33）pg/ml, p均<0.01］，而tet组与假手术组相比表达明显增强［（208.40±25.12）pg/ml∶（61.45±9.20）pg/ml,(587.40±137.40）pg/ml∶（229.25±90.13）pg/ml, p均<0.01］。tet组大鼠心肌细胞胞浆中p-iκb-α的表达明显低于i/ r 组［（0.0817±0.09）pg/ml∶（0.1755±0.01）pg/ml,但明显高于假手术组［（0.0817±0.09）pg/ml∶（0.0513±0.03）pg/ml, p均<0.01］。WwW.11665.coM结论：tet可以抑制iκb-α磷酸化，显著减少前炎症因子tnf-α、il-6的产生，减轻心肌缺血/再灌注损伤。
【关键词】 粉防己碱;再灌注损伤;肿瘤坏死因子-α;白细胞介素-6
tetrandrine inhibited iκb-α phosphorylation regulated the expression of tnf-α、il-6 during rat myocardial ischemic reperfusionwang yuqin cao xuebin feng yibaidepartment of cardiology， the pla 252 hospital,baoding,hebei,071000,chinaabstract：objective:to investigate the effect and mechanism of tetrandrine(tet) on the phosphorylation of iκb-α（p-iκb-α） and the expression of tnf-α，il-6 during rat myocardial ischemic/reperfusion(ir) period.methods:a total of 60 male sprague-dawley rats were randomly divided into 3 groups: sham group,i/r group, tet group.the sprague-dawley rat underwent 30 min of left anterior descending (lad) coronary occlusion and 24 h reperfusion to make ischemia/reperfusion (i/r) injury model in vivo.sham group were not subjected to occlusion of artery.tet group were injected with tetrandrine to abdominal cavity 20 min before ischemic starting.the other procedures were same to the i/r group.samples were collected after 24h reperfusion.the expression level of tnf-α and il-6 protein was detected by elisa.the expression of p-iκb-α was observed by immunohistochemical stain and image analysis.results:in tet group the expression of tnf-α 、il-6 were significant lower compared with those of i/r group［（208.40±25.12）pg/ml vs.(306.65±17.78）pg/ml,(587.40±137.40）pg/ml vs.(1003.75±138.33）pg/ml, p<0.01 all］ and significant higher than shame group respectively［（208.40±25.12）pg/ml vs.(61.45±9.20）pg/ml,(587.40±137.40）pg/ml vs.(229.25±90.13）pg/ml, p<0.01 all).in tet group the expression of p-iκb-α were significant lower than that of i/r group［（0.0817±0.09）pg/ml vs.(0.1755±0.01）pg/ml, and significant higher than that of shame group［(0.0817±0.09）pg/ml vs.(0.0513±0.03), p<0.01 all］.conclusion:tetrandrine can attenuate myocardial ischemia/reperfusion injury,inhibit the iκb-α phosphorylation and reduce the harmful cytokine tnf-α and il-6.
key words：tetrandrine;reperfusion injury; tumor necrosis factoralpha; interleukin-6
肿瘤坏死因子-α(tnf-α)和白细胞介素-6（il-6）是由激活的巨噬细胞或单核细胞产生的，具有多种生物学效应的细胞因子［1］。心肌组织进行再灌注循环时,巨噬细胞和心肌细胞本身受刺激分泌产生前炎症因子tnf-α和il-6。核转录因子（nf）κb的抑制因子（iκb-α）与nf-κb 以三聚体的形式结合在一起，当iκb-α磷酸化为磷酸化iκb-α（p-iκb-α）后可以解除对nf-κb 的抑制，使之得以转位，由细胞浆进入细胞核发挥调控前炎症因子tnf-α、il-6的生物活性作用。tnf-α产生过程中的转录因子，在心肌缺血再灌注引发的氧化应激中可以激活nf-κb[2]，活化的nf-κb导致黏附分子、细胞因子和趋化因子的转录激活,促进心肌缺血再灌注后的炎症反应，活化的nf-κb在缺血介导的心脏产生前炎症因子的过程中起重要作用[3]。粉防己碱（tet）是从中药防己科植物粉防己根中提取的生物碱，为双苄基异喹啉衍生物。它具有减少缺血区炎症细胞浸润，抑制炎症介质的产生，减轻心肌缺血/再灌注损伤的药理作用[4，5]。本实验采用大鼠心肌缺血再灌注模型，观察tet对心肌组织内p-iκb-α表达水平以及对tnf-α、il-6表达的影响。
1 资料与方法
1.1 主要试剂及仪器
粉防己碱由华中科技大学同济医学院药理教研室提供（纯度＞98％）；tnf-α、il-6酶联免疫吸附法（elisa）检测试剂盒由晶美公司提供;p-iκb-α单克隆抗体由santacruz公司提供（sc-7977-r）, sp 试剂盒和dab 由武汉晶美公司提供。其余化学试剂均为国产分析纯产品。
1.2 实验分组及动物模型的制备
大鼠心肌缺血/再灌注模型制备：使用250～300g sd大鼠(由华中科技大学同济医学院医学实验动物中心提供)。用1%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔内注射麻醉，行气管插管，连接小型动物呼吸机(modeldh-140，浙江大学医疗器械公司)，按15 ml/kg潮气量，频率60次/min，呼吸比为2∶1运行。在左侧3～4肋间暴露心脏，于左心耳与肺动脉圆锥间穿6/0号丝线，进行硅胶管套扎，形成心肌缺血。当肉眼观察到结扎点远端心前壁变紫、心电图显示st段抬高、t波高耸为模型成功，抬高的st回落1/2以上为再灌注成功的标志。实施30min缺血，再灌注24 h，建立心肌缺血/再灌注模型。整个实验过程中，用多道生理记录仪连续记录标准肢体ⅱ导心电图。
1.3 实验方案
共60只雄性sd大鼠。按随机化原则将大鼠分为以下3组：缺血/再灌注损伤(i/r)组：手术前30min腹腔注入生理盐水1.2ml，按上述步骤进行缺血30min，再灌注24 h；假手术组：于缺血/再灌注前30min腹腔注入生理盐水1.2ml，只行假手术，即在肺动脉圆锥与左心耳间穿线，不结扎，30min关胸，24 h后处死大鼠；粉防己碱治疗组(tet)：手术前20min腹腔内注射粉防己碱3mg/kg（约1.2ml），余同i/r组。
1.4 检测指标及方法
（1）心肌细胞tnf-α的表达:精确称取各组缺血部位心肌组织300mg,加入冷磷酸盐缓冲液（pbs）(4℃),匀浆器迅速制备心肌匀浆,3000r离心5min,取上清-70℃温箱保存，按tnf-α ellsa检测试剂盒操作说明书进行；（2）心肌细胞胞浆p-iκb-α表达水平测定：石蜡切片经常规脱蜡、水化, 滴加第一抗体(p-iκb-α) 后, 以免疫组化sp 法对切片标本进行染色,dab 显色, 蒸馏水洗脱水、透明、封片。每个标本在显微镜下观察p-iκb-α的活化表达, 阳性染色为胞浆显现棕色颗粒。阴性对照以pbs代替一抗。以hmias-2000型全自动医学彩色图像分析系统进行图像的平均光度分析来比较各组表达p-iκb-α的水平高低。
1.5 统计学处理
用spss13.0统计软件分析。计量资料用均数±标准差(±s)表示,组间比较用方差分析。多组间两两比较用最小显著差值（lsd）法。p<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 心肌组织tnf-α、il-6的表达
①i/r组tnf-α、il-6水平显著高于假手术组和tet组（p<0.01）；②tet组tnf-α、il-6的表达水平明显低于i/r组（p<0.01）见表1。表1 各组大鼠的肿瘤坏死因子（tnf）-α和白介素（il）-6水平比较(略)注：与假手术组比较△△p<0.01;与缺血再灌注组比较▲▲p<0.01。
2.2 心肌细胞胞浆中p-iκb-α的表达
①i/r组p-iκb-α平均光度的表达显著高于假手术组和tet组（p<0.01）；②tet组p-iκb-α平均光度的表达水平明显低于i/r组（p<0.01），但明显高于假手术组（p<0.01），见图1（封三）。
3 讨 论
本实验结果显示,tet可抑制iκb-α的磷酸化，显著减少前炎症因子tnf-α、il-6 的生成,具有减轻缺血/再灌注损伤的保护作用。心肌持续性缺血可导致组织损伤和细胞死亡,早期再灌注尽管对组织非常重要,但再灌注后循环中白细胞附壁、聚积,渗出血管而浸润心肌,导致心肌细胞坏死,加之补体激活以及活性氧的产生,致使缺血性心肌损伤更为严重,即为再灌注损伤。tnf-α和il-6是在缺血再灌注损伤过程中由炎症浸润细胞产生的前炎症细胞因子,可以导致心肌机能障碍和心肌细胞坏死[6]。近年来,tnf与缺血再灌注损伤的关系以及抗tnf治疗日益受到重视[7]。体外细胞培养发现tet对正常白细胞分泌tnf-α具有明显抑制作用[8]。tet可明显降低缺血-再灌注后tnf-α水平，而且tnf-α水平的降低与心肌梗死面积的缩小之间存在显著相关关系[4]。iκb-α与非活化状态的nf-κb以三聚体形式存在于细胞浆中，抑制nf-κb使之处于非活化状态。iκb-α磷酸化后成为p-iκb-α，可解除对nf-κb的抑制，使之得以活化，转位进入细胞核发挥其调控作用。tnf-α、白细胞介素等前炎症因子均是nf-κb活化的刺激因素,能通过多种不同的信号转导途径,激活nf-κb。nf-κb活化后参与调控一系列前炎症细胞因子的进一步生成如：tnf-α、il-6等[9],而这些物质都能直接或间接地参与心肌缺血-再灌注损伤。这样就形成了一个以细胞浆中iκb-α磷酸化解除nf-κb抑制为关键点，心肌细胞为中心的缺血/再灌注后炎症反应的恶性反馈环路，抑制iκb-α磷酸化进而阻止nf-κb转位进入细胞核就成为打破此环路的关键，由此可以起到减轻缺血/再灌注损伤的作用。本实验发现tet组的tnf-α、il-6含量明显低于i/r组（p<0.01）， tet组心肌细胞胞浆中p-iκb-α的表达水平明显低于i/r组（p<0.01）。这表明缺血/再灌注心肌细胞可以生成大量tnf-α和il-6，同时也使细胞浆中的iκb-α磷酸化为p-iκb-α。tet可以抑制iκb-α的磷酸化，显著减少前炎症因子tnf-α和il-6的生成。其心肌保护的可能机制为：①tet降低急性炎症期血管通透性、抑制中性粒细胞激活、浸润，减轻局部炎症[10]，减少炎症浸润细胞的减少使得前炎症因子的生成；②tet抑制iκb-α磷酸化。
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