摘要：对米曲霉（aspergillus oryaze）gn-2菌株产中性蛋白酶固体发酵的条件进行优化。单因素试验结果表明，米曲霉的固体适宜发酵条件为发酵原料麸皮∶豆粉为4∶1（质量比，下同），培养时间60 h，培养温度25 ℃，培养基加水量10 ml，接种量1×106个/ml孢子悬液2.0 ml，培养基起始ph 6.0，0.02%（nh4）2so4溶液1 ml。正交试验结果表明，在温度25 ℃、加水量20 ml、麸皮∶黄豆粉为4∶1、培养时间72 h的条件下酶活力最高，达1 016.9 u/g。
　　关键词：米曲霉（aspergillus oryaze）；中性蛋白酶；产酶条件
　　中图分类号：tq925；q93-33 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2014）07-1637-04
　　optimizing the solid fermentation conditions of neutral protease from
　　aspergillus oryzae gn-2 strain
　　huang yan，ju lu-ning
　　（minbei vocational and technical college， nanping 353000，fujian，china）
　　abstract： the optimal solid fermentation conditions of neutral protease from aspergillus oryzae gn-2 strain was studied. the results of single factor test showed that the highest neutral protease activity was obtained under the conditions of wheat bran and soybean powder addition ratio 4∶1， fermentation time 60 h，temperature 30 ℃，water addition 10 ml， inoculum amount 2.0 ml 1×106 spores/ml spore suspension， the initial medium ph 6.0，0.02%（nh4）2so4 1 ml. the results of orthogonal experiment showed that the highest neutral protease activity was obtained when the solid fermentation was carried out at 25 ℃ for 72 h， water addition 20 ml and the addition ratio of wheat bran and soybean powder 4∶1， with the highest neutral protease activity of 1 016.9 u/g.
　　key words： aspergillus oryzae； neutral protease； enzyme production conditions
　　中性蛋白酶是指最适作用ph介于6.0～7.5的一类蛋白酶，能催化蛋白质肽键水解。wwW.11665.COM它是最早发现并广泛应用于工业生产的蛋白酶制剂，被广泛应用于皮革脱毛、饲料加工、畜禽血液蛋白质水解、酒和饮料的澄清以及医药治疗等领域[1-3]。
　　米曲霉（aspergillus oryaze）具有丰富的蛋白酶系，能产生酸性、中性和碱性蛋白酶，能耐受较高温度，广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中[4]。米曲霉易于固体培养，所产的中性蛋白酶热稳定性高，有利于酶制剂的制作和保存，培养原料来源广泛，价格便宜，用于食品行业和化妆品行业将有广泛的前景[5]。吴继星等[6]研究表明，微生物培养基组成与产酶有极大的相关性。近年来，研究者采用正交设计的方法对培养基组分和培养条件进行优化筛选，并取得一定成效[7]。
　　本研究从酿造酱油曲精中分离到一株米曲霉菌株，命名为gn-2，研究了培养条件对米曲霉gn-2产中性蛋白酶的影响，通过正交试验确定了其中4个影响因素的最优组合，为该菌株的开发利用奠定了基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　菌株来源：米曲霉gn-2，从上海迪发酿造生物制品有限公司优质酱油曲精分离纯化得到。
　　pda培养基：马铃薯200 g/l，蔗糖20 g/l。
　　豆粉汁培养基：mgso4 0.5 g/l，kh2po4 1.0 g/l，（nh4）2so4 0.5 g/l，可溶性淀粉20 g/l，黄豆汁1 l。
　　发酵培养基：黄豆粉3 g，麸皮12 g，去离子水15 ml，装入250 ml三角瓶搅拌混合均匀。
　　1.2 主要试剂和仪器
　　主要试剂：干酪素（国药集团化学试剂有限公司）；l-酪氨酸（上海翔军生物科技有限公司）；福林酚试剂（上海分子免疫生化实验室有限公司）。
　　主要仪器：yc-w型冷冻恒温振荡器（镇江格瑞生物工程有限公司）；隔水式恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；tgl-16m型高速台式冷冻离心机（湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司）；721e型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；dhg-9070型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；sw-cj-2fd型双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；alc-114型电子分析天平（北京赛多利仪器有限公司）；ph211c型台式数显酸碱度计（意大利hanna）。 1.3 方法
　　1.3.1 菌种的分离

化 挑取2环曲精于100 ml无菌生理盐水中，磁力搅拌器搅拌30 min打散孢子，采用稀释平板涂布法对供试菌种进行分离纯化。培养后，挑取生长快、产孢子致密、表面颜色一致的单菌落，移入pda斜面培养基，培养后置于4 ℃冰箱保存。
　　1.3.2 孢子悬液的制备 挑取斜面培养基米曲霉gn-2孢子两环，于100 ml无菌生理盐水中，磁力搅拌器搅拌30 min打散孢子，取样置于光学显微镜下，利用血球计数板计数，调整孢子密度约为1×106 个/ml。
　　1.3.3 发酵条件 取接种孢子悬液2.0 ml于发酵培养基中，30 ℃恒温培养72 h。
　　发酵培养基配方为麸皮∶黄豆粉=4∶1，加水量为15 ml，装料量15 g。
　　1.3.4 蛋白酶活力测定 参照文献[8]绘制l-酪氨酸标准曲线并测定中性蛋白酶的活力。酶活力单位定义：40 ℃、ph 7.2条件下，每克米曲霉l min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸定义为1个中性蛋白酶活力单位（u/g）。
　　1.3.5 发酵条件对米曲霉gn-2产中性蛋白酶的影响
　　1）发酵时间。发酵培养基接种后，分别在24、36、48、60、72 h取样，测定酶活力。
　　2）培养基组分。在总量不变前提下，控制发酵培养基中麸皮与黄豆粉的比例分别为1∶4、2∶3、1∶1、3∶2和4∶1，灭菌后接种培养，取样测定酶活力。
　　3）培养基加水量。发酵培养基中分别加水10、15、20、25、30 ml，其他发酵条件不变，灭菌后接种培养，取样测定酶活力。
　　4）温度。将接种后的发酵培养基分别置于20、25、30、35、40 ℃培养72 h，取样测定酶活力。
　　5）接种量。发酵培养基中加水量分别为14.5、14.0、13.5、13.0、12.5 ml，灭菌后分别接入0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 ml孢子悬液，培养后取样测定酶活力。
　　6）培养基起始ph。在发酵培养基中分别加入适量的1 mol/l hcl或naoh溶液，调整后使培养料的ph分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，灭菌接种后培养，取样测定酶活力。
　　7）无机盐。以15 ml下列无机盐溶液：0.05% mgso4·7h2o、0.1%k2hpo4、0.2%kno3、0.001%feso4·7h2o和0.02%（nh4）2so4，代替发酵培养基中的去离子水，灭菌接种后培养，取样测定酶活力。
　　以上各试验每个处理3次重复。
　　8）发酵条件的正交试验。根据单因素试验筛选结果，选择培养时间、培养基组分（麸皮∶豆粉）、加水量、培养温度4个因素进行发酵条件的正交试验，按照l9（34）设计4因素3水平试验，9个组合，3次重复，优化发酵条件。正交试验因素和水平如表1所示。
　　1.3.6 粗酶液的制备 准确称取固体发酵样品5 g于25 ml，ph 7.2的0.5 mol/l磷酸缓冲液中，搅拌均匀后于40 ℃恒温振荡锅中，100 r/min浸提30 min。浸提液过滤后所得滤液即为粗酶液，用于后期测定。
　　1.4 数据处理与分析
　　采用excel 2003和spss 15.0软件对数据进行单因素方差分析，差异显著性分析采用多重比较法（lsd），数据为平均值±标准差。
　　2 结果与分析
　　2.1 酪氨酸标准曲线的绘制
　　在波长680 nm处，酪氨酸浓度在10～80 mg/l范围内线性关系良好，其回归方程为y=0.092 9x+0.015 8，r2=0.991 5。标准曲线如图1所示。
　　2.2 发酵时间对产酶的影响
　　图2结果表明，在试验时间范围内，米曲霉gn-2菌株产中性蛋白酶活力呈先升高后降低的变化规律。当发酵时间为60 h时，中性蛋白酶酶活力达到最高值，为（244.1±8.93） u/g。之后继续培养，中性蛋白酶活力降低。
　　2.3 培养基组分对产酶的影响
　　图3结果表明，发酵培养基中麸皮与黄豆粉的比例对米曲霉gn-2产中性蛋白酶有明显影响。麸皮所占比例越大，米曲霉gn-2产中性蛋白酶的酶活力越高。当麸皮∶黄豆粉=4∶1时，酶活力达到最大值，为（538.6±12.21） u/g。这可能与麸皮原料对米曲霉产中性蛋白酶的诱导作用有关。
　　2.4 培养基加水量对产酶的影响
　　由图4可以看出，培养基加水量对米曲霉gn-2产中性蛋白酶有明显影响。在本试验条件下，产酶最适加水量为10 ml，且随着培养基加水量的增加，中性蛋白酶酶活力逐渐下降。可能一方面是由于培养基含水量过高，菌丝体前期徒长，形成孢子的时间延长，使中性蛋白酶产量下降；另一方面，培养基含水量过高致使培养基的透气性下降，氧气供给不足，使菌体生长不良，产酶量也下降。
　　2.5 温度对产酶的影响
　　由图5可以看出，温度对米曲

霉的产酶能力有较大的影响。25 ℃以下，菌体生长缓慢，产酶量较少。温度高于30 ℃时，产酶量迅速下降。培养温度为25、30 ℃时，酶活力较高。当培养温度为25 ℃时，酶活力达到最高值，为（635.6±16.31） u/g。当培养温度为40 ℃时，可能由于固体发酵料中心热量不能及时扩散，导致烧曲现象，以至酶活力降到最低点，约为最高值的4.57%。
　　2.6 接种量对产酶的影响
　　表2结果表明，接种量可影响米曲霉gn-2产中性蛋白酶的活力。随着接种量的增加，米曲霉产酶能力呈先增强后减弱的趋势；当接种量为2.0 ml时，中性蛋白酶酶活力最高，达到（656.3±16.64） u/g。可能是因为接种量过小时，菌体生长缓慢，发酵迟缓；接种量过大时，则因菌体生长过快导致营养和氧气缺乏，从而影响酶的产生[3]。 2.7 培养基起始ph对产酶的影响
　　表3结果表明，培养基起始ph对米曲霉产中性蛋白酶有一定影响。随着培养基起始ph的增大，中性蛋白酶酶活力呈先升高后降低的变化趋势；ph 为6.0时，酶活力最高，达到（589.4±15.22） u/g。ph为7.0时，酶活力下降到（461.5±13.85） u/g。当ph为9.0时，酶活力降低到最小值，为（315.9±11.76） u/g。
　　2.8 无机盐对产酶的影响
　　由表4可知，无机盐对米曲霉产中性蛋白酶也有影响，mg2+、k+、nh4+对产酶有促进作用，fe2+对产酶有明显的抑制作用。当无机盐为0.02%（nh4）2so4溶液时，中性蛋白酶酶活力最高，达到（859.6±16.34） u/g。
　　2.9 发酵条件的正交试验结果
　　在单因素试验的基础上，采用正交试验优化培养基中各组分的配比与培养条件。由表5可知，试验条件下优化水平的最佳组合为a1b3c3d3，米曲霉gn-2产中性蛋白酶的最优培养基配方与培养条件为培养基组分麸皮∶豆粉为4∶1、培养温度25 ℃、加水量20 ml、培养时间72 h。极差分析可知，各因子对酶活力影响大小顺序为培养温度、培养基组分、培养时间、加水量。方差分析（表6）表明，培养温度对产酶量的影响显著，而发酵培养基组分、培养时间以及加水量对产酶量的影响不显著。按照最佳组合试验得到的酶活力为1 016.9 u/g。
　　3 结论与讨论
　　单因素试验表明，固体发酵的适合产酶条件为麸皮∶黄豆粉为 4∶1，发酵时间 60 h，培养温度25 ℃，培养基加水量10 ml，接种量2.0 ml孢子悬液，培养基起始ph 6.0，无机盐0.02%（nh4）2so4 1 ml。正交试验结果表明，培养温度为25 ℃、加水量为20 ml、麸皮∶豆粉为4∶1、培养时间为72 h 的组合酶活力最高，达1 016.9 u/g。笔者在后续试验中采用该正交试验的优化条件，进行了3次发酵培养，结果酶活力均值为（993.6±14.62） u/g。说明经过优化，酶活力得到了提高。
　　中性蛋白酶可以从动植物组织中提取，也可以通过微生物生产。由于动植物资源受到各种条件的限制，不易扩大生产。而微生物具有生长快、种类多等优点，且微生物易变异，通过菌种改良可以进一步提高酶的产量，改善酶的生产和酶的性质，因此目前工业酶制剂大部分都是通过微生物发酵进行大规模制造的。可以生产蛋白酶的微生物有细菌、放线菌和真菌等。米曲霉可以生产多种酶，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等，中性蛋白酶为其中的一种。米曲霉是一种常用的酶制剂生产菌种。本试验主要探讨了多种因素对米曲霉固体发酵产中性蛋白酶的影响，得到的试验结果与前人的研究结果[4，5]基本一致。但是若要应用于生产实践，需要根据具体情况选择合适的条件。
　　在生产中，若能够提高菌株的产酶能力，则可节约生产成本，获得较大的经济效益。当前，有研究者通过理化因子诱变或者基因工程技术对菌株进行改良处理，筛选得到一些产酶能力较高的菌株。由于诱变具有不定向性，因此这方面的研究有待进一步深入。
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