【关键词】 脑缺血；细胞凋亡；凋亡通路；中药；综述
脑缺血后经一系列生化级联反应引起神经元凋亡,造成脑的相应区域的功能障碍而引发一系列的缺血症状。因此,寻找抑制脑缺血后神经细胞凋亡的有效药物,对改善缺血性脑卒中愈后显得尤为重要。
1 细胞凋亡的途径
1.1 死亡受体途径
细胞表面的死亡受体是肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族成员。主要包括：fas(cd95)、tnfr-1[1]、dr3(death receptor 3)[2]、dr4(death receptor 4)[3]、dr5(death receptor 5)[4]。目前研究最清楚的是fas-fas-l信号传导途径。
fas-l以同源三聚体复合物形式存在[5]。每一个fas-l三聚体可结合三个fas分子,导致三个fas分子细胞内的dd(death domain)相互串联。串联的fas的dd可以与fadd(fas-associated death domain)的dd结合。而这种结合又导致fadd的ded(death effect domain)与caspase-8酶原的ded类似区域结合,该区域是card(caspase recruitment domain)的一种,从而激活caspase-8,caspase-8进一步激活下游的caspase,最终导致细胞凋亡。Www.11665.Com
caspase-蛋白酶(含半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白酶)家族,目前被认为是执行细胞凋亡的中心环节[6]。凋亡信号通过激活上游caspase-进而激活下游caspase-,在凋亡执行阶段由下游caspase-(如caspase-3)对特定的底物(多为一些关键酶)进行切割,如激活核纤层蛋白、肌动蛋白等的蛋白酶及核酸内切酶等,抑制dna修复酶,从而破坏细胞骨架蛋白和核蛋白,使染色体断裂成小片断,这些不可逆转的改变导致细胞凋亡。
1.2 线粒体途径
当细胞受到各种因素的刺激(如缺血、缺氧等),细胞内部发生一系列病理改变,其中之一就是线粒体膜去极化,线粒体膜电位下降,线粒体通透性转变孔(mitochondrial permeability transition pore,mptp)开放,凋亡诱导因子(apoptosis- inducing factor,aif)、凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptotic protease-activating factor-1,apaf-1)和细胞色素c (cytochrome c,cyt c)等从线粒体释放出来[7]。一方面,apaf-1和cyt c在datp/atp存在的情况下,形成凋亡体,激活caspase-9,继而活化caspase-3,引起细胞凋亡；而另一方面,aif一旦释放至胞质即可直接到达细胞核。在细胞核内,aif可通过其dna结合区直接作用于核dna,也可以和另外一个线粒体蛋白核酸内切酶g(endonuclease g,endo g)一起,导致dna片断化,引起不依赖caspase的细胞凋亡过程。与此同时,胞浆中的aif能使线粒体释放更多的aif,形成一个自身放大的反馈调节,从而加速细胞凋亡。
线粒体释放促凋亡因子可受b细胞淋巴瘤-2(b-cell lymphoma-2,bcl-2)蛋白的调节[8],bcl-2家族蛋白可以分为两大类,一类是抑制细胞凋亡的,主要有bcl-2、bcl-xl、bcl-w及mcl-1等,另一类是促进细胞凋亡的,主要包括bax、bak、bcl-xs、bad、bik、bid等。bcl-2蛋白能直接与电压依赖性离子通道(vdac)结合使关闭；而bax等能加速vdac开放,使cytc从vdac漏出。bcl-2的蛋白表达受p53基因的调节[9],人们发现bcl-2 5′端有一个p53的负应答元件,p53与之结合后,可抑制bcl-2基因的转录。
2 中药对脑缺血后神经细胞凋亡的影响
2.1 单味中药或中药单体
2.1.1 银杏
张氏等[10]利用大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,观察银杏制剂——金纳多注射液对大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经细胞凋亡及bcl-2、bax蛋白表达的影响。结果金纳多能提高大鼠局灶性脑缺血再灌注后各时点的bcl-2蛋白表达,降低bax蛋白表达。季氏等[11]利用原代培养的大鼠大脑皮质神经元细胞,建立缺氧复氧的神经细胞损伤模型,同样也观察到银杏叶提取物能明显降低缺氧复氧损伤的神经细胞bax蛋白表达。
2.1.2 三七
李氏等[12]研究三七总皂苷(pns)对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织中caspase-1、caspase-3、caspase-8表达的影响。采用大鼠大脑中动脉栓塞局灶性脑缺血再灌注模型,观察到缺血再灌注后,脑组织caspase-1、caspase-3表达增强,pns能下调caspase-1、caspase-3蛋白的表达,但对caspase-8的表达无影响。提示pns能抑制脑缺血再灌注后caspase-1、caspase-3蛋白的表达,这可能是其促进脑缺血后神经元存活及损伤后修复的机制之一。 2.1.3 丹参 张氏等[13]采用沙土鼠前脑缺血再灌注模型,观察丹参注射液对脑缺血后的bcl-2蛋白表达的影响。结果显示与对照组相比,丹参组bcl-2的蛋白表达明显增加,特别是在海马ca1区及大脑皮层区。提示丹参能上调脑缺血后bcl-2表达,从而发挥其神经保护作用。
2.1.4 川芎
曲氏等[14]采用大鼠大脑中动脉栓塞局灶性脑缺血再灌注模型,探讨川芎中有效成分川芎嗪对脑缺血再灌注后脑组织bcl-2蛋白和fas-l蛋白表达的影响。结果显示,川芎嗪可上调脑缺血再灌注后皮质神经元bcl-2蛋白,下调fas-l蛋白的表达。这可能是川芎嗪对脑缺血损伤保护作用的机制之一。
2.1.5 人参
樊氏等[15]采用大鼠大脑中动脉栓塞模型,研究人参皂苷rb1、rb3、rg13种单体对caspase-3蛋白表达的影响。结果表明3种人参皂苷单体均有保护大鼠海马和皮层神经元抗缺血损伤、降低caspase-3蛋白表达的作用,其中以rb3作用最为明显。胡氏等[16]采用大鼠右侧大脑中动脉阻断局灶性脑缺血再灌注模型,研究人参皂苷rg1对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤时细胞凋亡以及caspase-3、bcl-2的蛋白表达的影响。结果表明,人参皂苷rg1对大鼠脑缺血再灌注损伤引起细胞凋亡的保护作用可能与其增加bcl-2蛋白,降低caspase-3蛋白表达有关。聂氏等[17]利用体外培养的神经细胞观察人参皂甙rb1对新生大鼠大脑皮层神经元缺氧损伤及bcl-2、bax蛋白的表达的影响,结果提示,人参皂甙rb1可通过提高bcl-2,降低bax蛋白的表达,提高bcl-2/bax比值来发挥对神经细胞的保护作用。
2.1.6 当归
杨氏等[18]应用大鼠局灶性脑缺血模型观察当归对脑缺血损伤的作用及对bcl-2、bax蛋白表达的影响。结果发现,当归能抑制bax蛋白的表达,而对bcl-2蛋白无影响,提示当归可能通过降低bax蛋白表达,减少脑缺血区细胞凋亡的发生。
2.1.7 黄芪
赵氏等[19]采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,探讨黄芪煎剂对脑缺血再灌注后神经细胞凋亡相关基因bcl-2、fas-l蛋白表达的影响。结果显示黄芪可能通过增强bcl-2蛋白表达,下调fas-l蛋白表达,发挥对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。蒋氏等[20]结扎新生大鼠一侧颈总动脉,观察到黄芪注射液可能通过减少caspase-3蛋白的表达发挥对新生大鼠未成熟脑组织缺血性损伤的保护作用。聂氏等[21]采用体外培养的新生大鼠大脑皮层细胞,研究黄芪注射液对神经细胞缺氧性损伤的保护作用,结果表明,黄芪可能通过提高bcl-2、降低bax蛋白的表达、提高bcl-2/bax比值减少脑缺血区细胞凋亡。
2.1.8 葛根
陈氏等[22]采用体外培养的鼠神经母细胞瘤细胞株n2a细胞建立缺血再灌注模型,研究中药葛根的有效成分——葛根素对缺血后神经细胞凋亡和caspase-3酶活性的影响,结果表明,葛根素能抑制缺血后神经细胞凋亡,并能抑制caspase-3酶的活性。曹氏等[23]采用大鼠急性全脑缺血再灌注模型,探讨葛根素对神经细胞凋亡及bcl-2、bax蛋白表达的影响,结果表明葛根素可能通过上调bcl-2、下调bax蛋白的表达来抑制缺血后神经细胞的凋亡。杨氏等[24]采用类似的方法观察到葛根素能通过抑制p53、fas蛋白的表达发挥抗缺血后神经细胞凋亡的作用。
2.1.9 石菖蒲
方氏等[25]观察石菖蒲不同组分(去油水提液、含油水提液、挥发油、β-细辛醚)对大鼠脑缺血再灌注损伤神经细胞凋亡的影响。结果显示,石菖蒲内的挥发性物质β-细辛醚有明显抑制大鼠大脑皮质神经细胞凋亡的作用。β-细辛醚能抑制大鼠脑皮质和海马神经细胞bax基因表达,增强大鼠脑皮质神经细胞bcl-x基因的表达。提示石菖蒲挥发油尤其是β-细辛醚有抑制大鼠神经细胞凋亡的作用。
2.2 中药复方
王氏等[26]采用大鼠脑缺血再灌注模型,研究补阳还五汤对脑缺血再灌注大鼠皮质神经细胞凋亡的影响。以电镜观察线粒体的变化,免疫组化检测bcl-2/bax的表达。结果显示,脑缺血再灌注后缺血侧皮质神经细胞凋亡增多,同时bcl-2表达减少,bax表达增多,bcl-2/bax比值下降,线粒体肿胀且大多破裂。补阳还五汤干预后,细胞凋亡减少,脑梗死体积减小,bcl-2/bax比值上升,线粒体肿胀减轻。提示补阳还五汤可能通过上调bcl-2/bax比值,保护线粒体,防止发生线粒体通透性转变来阻止缺血后神经细胞凋亡。曲氏等[27]对补阳还五汤的一系列的研究认为,补阳还五汤能上调bcl-2基因的表达,下调p53基因表达,抑制缺血性神经细胞凋亡。唐氏等[28]发现,补阳还五汤中4类物质均可抑制caspase-1的表达,其中生物碱、苷、苷元还可抑制脑组织中不同部位的caspase-3的表达,4类物质对caspase-8的表达均无影响,提示caspase-1和caspase-3可能是补阳还五汤抗缺氧性脑损伤的主要物质基础。
陈氏等[29]观察到清开灵注射液可以通过降低新生大鼠缺血缺氧脑皮质的fas-l蛋白的表达,抑制细胞凋亡,发挥对神经细胞的保护作用。
王氏等[30]采用大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,探讨复方丹参对大鼠脑缺血再灌注后海马和齿状回神经细胞凋亡及bcl-2 mrna表达的影响。结果显示,复方丹参组神经细胞bcl-2 mrna的表达明显强于缺血再灌组,且凋亡神经细胞数明显较低。提示复方丹参可通过上调神经细胞bcl-2 mrna的表达,抑制神经细胞凋亡,减轻缺血再灌注对大鼠海马和齿状回的损伤。
陈氏等[31]运用大鼠局灶性脑缺血损伤模型,观察回神颗粒复方对大鼠局灶性脑缺血后神经细胞凋亡,以及调控基因bcl-2、bax蛋白的影响。结果表明,回神颗粒复方可以通过增加bcl-2表达,减少bax表达,上调bcl-2/bax比值来抑制缺血后神经细胞凋亡,保护受损伤的神经细胞。
赵氏等[32]研究发现,芪丹通脉片能抑制脑缺血-再灌注大鼠神经细胞凋亡,下调fas-l、上调bcl-2蛋白表达。并且芪丹通脉片拆方：黄芪组、活血组均能上调bcl-2蛋白表达,但作用以总方最强。何氏等[33]对其研究发现,参脉注射液能抑制大鼠脑出血后血肿周围缺血区域的神经细胞凋亡,增加bcl-2基因表达,减少bax基因表达。李氏等[34]观察脑络欣通脑缺血再灌注大鼠神经细胞凋亡及p53蛋白表达的影响,发现脑络欣通可明显抑制脑缺血后神经细胞凋亡和p53蛋白的表达。而王氏等[35]类似的实验则表明,脑络欣通抗缺血后神经细胞凋亡的作用与其能降低fas及fas-l蛋白表达有关。
3 展望
目前,具有抑制脑缺血后神经细胞凋亡作用的中药研究,不论是单味药还是复方,主要集中在活血化瘀药,其次为补益药。并且研究尚存在以下问题,一是研究水平不够深入,质量有待提高。主要是一般药效观察比较多,深入探讨中药作用机理的比较少,二是研究检测的指标单一,多是针对通路中一点,少有对整个通路的研究,并且多集中bcl-2/bax蛋白家族；三是研究使用的药物多缺乏质量标准,使得研究很难重复,也难以分析不能重复的原因。今后应加强不同中药有效成分和治疗不同证候群的辨证方剂的抗神经细胞缺氧凋亡的研究,加大抗神经细胞缺氧性凋亡研究的广度和深度,研究凋亡传导的各个途径和每条途径上的不同物质,以及不同途径的相互关系和不同传导物质间的相互联系。要建立统一规范的脑缺血动物及细胞模型,以使各结果间有可比性,减少重复。为提高中药研究水平,还应当建立药物的质量标准,特别是对于中药复方的研究,更应有中药复方的质量标准。要研究更多、更有效的抗神经细胞缺氧性凋亡的中药新药,同时也要为指导脑中风的临床治疗以及正确合理用药提供理论依据,并为中医治疗理论的创新,中西医在基础理论和临床实践上的结合做出贡献。
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