作者：程伟,秦文杰,陈素红,叶祖光

【摘要】  目的 为大乌泡资源的合理开发和利用提供试验依据。方法 采用60%甲醇提取大乌泡叶总黄酮,分光光度法测定其含量；并通过稳定性、重复性、精密度和回收率试验检验了该方法的可靠性和重复性。结果 标准液和供试液均在510 nm处有最大吸收。重复性、精密度、加样回收率试验的rsd值分别为2.11%、0.97%、2.34%,含量测定结果表明大乌泡叶中总黄酮含量为3.8%。结论 以60%甲醇提取、硝酸铝显色、510 nm测定的分光光度法适用于大乌泡叶中总黄酮含量的测定。

【关键词】  大乌泡；总黄酮；含量测定；分光光度法

    abstract：objective to supply scientific basis for the reasonable development and utilization of rubus multibracteatus levl. et vant. resources. method the total flavonoids was extracted from rubus multibracteatus levl. et vant. with 60% methanol and its content was determined by spectrophotometry. the reliability and repeatability of the method were tested through stability, repeatability, accuracy and recovery experiments. result both standard and tested solutions had the maximum absorbance at 510 nm. the rsd values of repeatability, accuracy and recovery experiments were 2.11%, 0.97% and 2.4% respectively. the results of content determination showed that the total flavonoids in rubus multibracteatus levl. et vant. was 3.8%. conclusion extracted with 60% methanol, colored with aluminiumnitrate and determined by spectrophotometry at 510 nm were suitable for the determination of total flavonoids in rubus multibracteatus levl.et vant..

    key words：rubus multibracteatus levl.et vant.；total flavonoids；content determination；spectrophotometry
 
    大乌泡为蔷薇科悬钩子属植物大乌泡(rubus multibracteatus levl. et vant.),又名倒生根、黄水泡、无刺乌泡、糖泡叶、马莓叶,以根及全株入药。wWw.11665.CoM全国大部分地区均有分布,主产于四川、云南、贵州等地。其味苦、性凉,入脾、肝二经,具清热解毒、祛风除湿、凉血、止血、接骨的功效。大乌泡为苗药的常用药,但目前尚未见对大乌泡化学成分研究的报道,我们通过对大乌泡叶的化学成分的系统研究,发现其中含有许多黄酮类成分(另文报道),现就大乌泡叶中总黄酮的含量测定方法报道如下。

　　1  仪器与试药

    uv-757crt紫外分光光度计(上海unico),ab135-s电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司),cq-250超声波清洗器(上海超声仪器厂),电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器厂),索氏提取器。

    芦丁对照品(中国药品生物制品检定所提供,批号10080- 200306)。本研究所用大乌泡叶于2007年7月采集于贵州省黔西南州普安县,经秦文杰副研究员鉴定为蔷薇科悬钩子属大乌泡(rubus multibracteatus levl.et vant.),标本存放于中药复方新药开发国家工程研究中心。甲醇为分析纯,5%亚硝酸钠、10%硝酸铝、4%氢氧化钠等均采用分析纯自配。

　　2  方法与结果

　　2.1  供试品溶液的制备

    干燥大乌泡叶粉末约2.0 g,精密称定,置索氏提取器中,加入60%甲醇100 ml,于恒温水浴锅上90 ℃提取6 h,过滤,减压浓缩并定容至50 ml容量瓶中,得供试品溶液。

　　2.2  芦丁对照品溶液的制备

    精密称取干燥至恒重的芦丁对照品4.75 mg,用少量60%甲醇溶解,置50 ml容量瓶中,用60%甲醇定容至50 ml,摇匀,静置,配成浓度为95 μg/ml的芦丁对照品贮备液。

　　2.3  测定波长的选择

    以芦丁为对照品测定大乌泡叶中总黄酮的含量。精密吸取对照品液、供试品液各适量分别加入到25 ml容量瓶中,按“2.4”项下方法操作,并在400～600 nm范围内扫描,结果均在510 nm处有最大吸收波长,其他成分对测定无干扰,故选择510 nm为测定波长。

　　2.4  标准曲线的绘制

    精密吸取浓度为95 μg/ml的芦丁对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml,分别置于25 ml量瓶中,分别加入5%亚硝酸钠溶液1.0 ml,摇匀,放置6 min后各加入10%硝酸铝溶液1.0 ml,摇匀后放置6 min,分别加入4%氢氧化钠溶液10 ml,用60%甲醇稀释至刻度,摇匀,放置10 min,在510 nm处测定吸光度。回归方程为：y＝0.001 2x＋0.001,r＝0.999 6。结果表明,芦丁对照品溶液浓度在95～570 μg/ml之间呈良好的线性关系。

　　2.5 方法学考察

　　2.5.1  精密度试验 

　　精密吸取95 μg/ml芦丁对照品溶液5.0 ml,置于25 ml量瓶中,按“2.4”项下方法进行显色和测定,重复6次实验,记录吸光度。吸光度的rsd＝0.97%(n＝6),说明仪器精密度良好。

　　2.5.2  重复性试验 

　　精密称取样品6份,每份约2.0 g,精密称定,按“2.1”项下方法制备供试品溶液,每份精密吸取1.0 ml,分别置于10 ml容量瓶中,按“2.4”项下方法进行显色和测定,记录吸光度值,计算每份样品的含量。6份样品黄酮含量的rsd＝2.11%(n＝6)。

　　2.5.3  稳定性试验 

　　精密称取样品6份,每份约2.0 g,按“2.1”项下方法制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液1.0 ml,共6份,分别置于10 ml量瓶中,按“2.4”项下方法进行显色和测定,分别在15、20、30、45、60、100 min测定,rsd＝1.38%(n＝6)。结果表明样品在15～100 min之间稳定。

　　2.5.4  加样回收率试验 

　　精密称取芦丁对照品适量,加入已知含量的对照品,称取样品6份,每份约1.0 g,精密称定,按供试品溶液制备方法制成溶液6份,各取1.0 ml,置于10 ml量瓶中,按“2.4”项下方法进行测定,结果见表1。表1  加样回收率试验结果（略）

　　2.6  样品含量测定

    精密称取样品6份,每份约2.0 g,按“2.1”项下方法制备供试品溶液。每份精密吸取1.0 ml,分别置于10 ml量瓶中,按“2.4”项下方法进行显色和测定,由标准曲线计算得大乌泡中总黄酮平均含量为3.8%,rsd＝2.4%,说明该方法测得的含量是可靠的。表2  大乌泡叶中总黄酮含量测定结果（略）
 
　　3  讨论

    本试验用硝酸铝作为黄酮类比色测定的显色剂,主要是黄酮母核中含有碱性氧原子,一般又多带酚羟基,能和铝离子产生黄色络合物,又加入亚硝酸钠和氢氧化钠,使在碱性溶液中显红色,显色反应在100 min内稳定[1]。
   
　　对样品的提取方法进行考察,超声、加热回流和索氏提取3种提取方法中,采用索氏提取总黄酮,测得吸光度值最大[2]。

    对显色系统和显色系统浓度分别进行考察,结果表明5%亚硝酸钠、10%硝酸铝、4%氢氧化钠溶液显色,吸光度值最大。

    采用紫外分光光度法对大乌泡叶中总黄酮的含量进行测定,是一种方便有效的含量测定方法。

【参考文献】
  　[1] 周桂芬,张涵苦.苣菜中黄酮类化合物的含量测定[j].中华中医药学刊, 2008,26(1)：219－220.

　　[2] 腾小弘,刘 威.紫外分光光度法测定复方山楂片中总黄酮含量[j].辽宁中医杂志,2008,35(2)：261－262