作者：韩伟,章军,吴立军,李娆娆
【摘要】 目的 建立芫花根中芫花酯甲的定性鉴别和定量分析方法。方法 采用薄层色谱法对芫花根中芫花酯甲进行定性鉴别,采用高效液相色谱法测定芫花酯甲的含量。色谱条件：kromasil c18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相为甲醇-水(85∶15),流速1.0 ml/min；柱温40 ℃；检测波长为238 nm；记录时间40 min。结果 芫花根中芫花酯甲的薄层色谱鉴别特征明显、专属性强；含量测定线性范围为0.047～0.282 μg(r＝0.999 6)；平均回收率为99.2%,rsd＝2.00%(n＝6)。结论 该方法操作简便,结果准确,能够对芫花根中的芫花酯甲进行定性鉴别和定量分析,提高了该药材的质量控制水平。
【关键词】 芫花根；芫花酯甲；薄层色谱法；高效液相色谱法
abstract：objective to develop qualitative identification and quantitative analysis method of yuanhuacin in root of daphne genkwa sieb.et zucc. method yuanhuacin was identified by tlc and its content was determined by hplc. kromasil c18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm) column was used. the mobile phase was methanol-water (85∶15) at a flow rate of 1.0 ml/min. the column temperature was 40 ℃. the detection wavelength of yuanhuacin were set at 238 nm. the record time was 40 min. results the linear range of yuanhuacin was 0.047～0.282 μg (r＝0.999 6). the average recovery was 99.2% with rsd＝2.0% (n＝6). conclusion these analytical methods were simple and accurate, and can be used for the qualitative identification and quantitative analysis of yuanhuacin. it is suitable for quality control of root of daphne genkwa sieb.et zucc.
key words：daphne genkwa sieb.et zucc；yuanhuacin；tlc；hplc
芫花根为瑞香科植物芫花daphne genkwa sieb.et zucc.的干燥根,广泛分布于我国长江流域各省和黄河流域的部分地区。www.11665.cOM本品味辛、苦,性温,有毒；具有逐水、解毒、散结等功效；用于治疗水肿、乳痈等。本品主要含二萜类、黄酮类和香豆素类成分[1]；芫花酯甲为主要的二萜类成分,具有利水作用,能直接兴奋子宫平滑肌,为引产药的有效成分,还能抑制p388癌细胞核酸和蛋白质的合成,有抗白血病作用。该成分具有强烈的刺激性,对皮肤、黏膜系统有较大的毒害作用,是芫花根利水、抗生育作用的有效成分,也是毒性成分。本试验对芫花根中芫花酯甲进行定性定量研究,以期为提高芫花根的质量控制水平提供试验数据。
1 仪器与试药
薄层成像系统transillvminator2020d型(冷泉港科技有
限公司)；merck tlc薄层板(德国merck公司)；waters高效液相色谱仪(600 pump；waters 600 controller；waters 2487 dual λ absorbance detector)；millennium32色谱管理软件；cx-250超声波清洗器(北京医疗设备二厂,功率250 w,频率40 khz)。
芫花酯甲对照品为自制,经1h nmr和13c nmr鉴定结构,hplc检测其纯度,面积归一化法计算对照品的含量在98%以上,符合对照品纯度要求。甲醇为色谱纯,水为自制高纯水。其余试剂均为分析纯。
芫花根采自河南信阳,经笔者鉴定来源于瑞香科植物芫花daphne genkwa sieb.et zucc.的干燥根。
2 定性鉴别
取本品粉末10 g,置于100 ml三角烧瓶中,用95%乙醇80 ml回流提取1.5 h,提取液回收至无醇味,加水分散,用石油醚(60～90 ℃)萃取,回收溶剂至干,溶解于1 ml甲醇中,得供试品溶液。另取芫花酯甲加甲醇制成每1 ml约含2 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅳb]试验,吸取上述溶液各15 μl,分别点于同一荧光板上,以苯-乙酸乙酯(1∶1)系统展开,取出,晾干,置紫外光灯(254 nm)下检视,样品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的暗斑。
3 含量测定
3.1 色谱条件
kromasil c18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；以甲醇-水(85∶15)为流动相；流速1.0 ml/min；柱温40 ℃；检测波长为238 nm。
3.2 溶液的制备
3.2.1 对照品溶液的制备
取芫花酯甲适量,精密称定,用甲醇溶解并定容,制成0.023 5 μg/μl的溶液,摇匀,即得对照品溶液。
3.2.2 供试品溶液的制备
取芫花根样品约5 g,置100 ml具塞锥形瓶中,准确加入三氯甲烷50 ml,超声(功率250 w,频率40 khz)30 min,滤过,用少量三氯甲烷洗涤残渣,洗液并入滤液中蒸干,残渣加50 ml甲醇,称重,回流1 h,放置,待其冷却至室温,称重,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液过微孔滤膜(0.22 μm),即得供试品溶液。
3.3 线性关系考察
取对照品溶液(0.023 5 μg/μl),分别进样2、4、6、8、10、12 μl,以芫花酯甲的进样量为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得芫花酯甲的回归方程为：y＝2 768 985.32x－
19 820,r＝0.999 6,结果表明进样量在0.047～0.282 μg范围内线性关系良好。
3.4 方法学考察
3.4.1 精密度试验
精密吸取同一样品5 μl,连续进样5次,按上述色谱条件测定峰面积,rsd＝1.43%,表明仪器性能良好。
3.4.2 重复性试验
取同一样品5份,按照供试品溶液的制备方法制备,分别进样5 μl,测定芫花酯甲的峰面积并计算含量,平均含量为0.023 6%,rsd＝1.69%(n＝5),表明本方法重复性较好。
3.4.3 稳定性试验
精密吸取同一样品,分别在样品制备后0、2、4、8、16、24 h进样5 μl,测定芫花酯甲的峰面积,rsd＝1.28%,表明样品溶液在24 h内稳定。
3.4.4 加样回收率试验
精密称取样品6份,各约2.5 g,分别精密加入对照品0.60 mg,按“3.2.2”项下方法制备供试液,分别精密吸取5 μl,测定芫花酯甲含量及加样回收率,结果平均回收率为99.2%,rsd＝2.00%。见表1。
3.5 样品测定
精密吸取按“3.2”项下方法制备的对照品溶液和供试品溶液各5 μl,分别进样测定。含量测定结果见表2,色谱图见图1。表2 芫花根样品含量测定结果（略）
4 讨论
薄层色谱显色条件的选择：本试验对比了偏钒酸铵-硫酸溶液显色和薄层板用荧光板在254 nm下检视为暗斑点两种显色方法。用荧光板点样量小,分离效果好,容易观察；同时发现用偏钒酸铵-硫酸显色,放置一段时间后,在自然光下芫花酯甲显蓝紫色斑点,效果比直接观察红棕色斑点好。
供试品溶液制备方法的选择：参考文献[2]的方法,经试验确定,选择三氯甲烷超声30 min、溶剂用量为50 ml的甲醇提取为最佳方法。检测波长的确定：采用光电二极管阵列检测器在200～400 nm对芫花酯甲色谱峰进行全波长扫描,发现在238 nm处有最大吸收,因此,选择238 nm为检测波长。
本试验测定了芫花根、根皮、木心、市售根饮片,发现市售根饮片经过浸泡、切制后,芫花酯甲的含量明显降低；在临床应用芫花根的时候可以去除体积较大的木心,直接应用根皮。本方法简便,准确性高,能够提高芫花根药材的质量标准,对于保证其临床药效具有参考价值。
【参考文献】
[1] 应百川,王成瑞,周炳南,等.芫花根有效成分的研究[j].化学学报,1975, 35(1)：103－107.
[2] 黄兰岚,李娆娆,原思通,等.不同产地芫花药材中芫花酯甲含量比较[j].中成药,2008,30(10)：附10－12.
