作者：李广斌，苏金玲，姜希娟，范英昌
【摘要】 目的探讨中药心复康在大鼠急性心肌梗塞后对移植骨髓间充质干细胞（bmscs）的保护作用及其机制。方法经密度梯度离心联合贴壁筛选法培养并纯化bmscs，采用冠状动脉结扎法建立大鼠急性心肌梗塞模型，移植前以5-溴脱氧尿核苷（brdu）对移植细胞进行标记，术后采用中药心复康灌胃联合干细胞移植治疗。移植后2周elisa法检测大鼠血清血管内皮生长因子（vegf）含量；处死动物，免疫组织化学方法检测心肌损伤区vegf蛋白表达情况、brdu阳性移植细胞数和cd34+新生血管数。结果心复康联合干细胞移植治疗大鼠心肌梗塞，能提高移植细胞存活率（与细胞移植组比较p<0.05），提高大鼠血清vegf含量（与细胞移植组比较p<0.05），提高梗塞区vegf蛋白表达，增加梗塞区新生血管数量。 结论中药心复康对大鼠急性心肌梗塞后移植干细胞有明显的保护作用，其机制可能与心复康联合干细胞移植能更有效地促进损伤区血管新生有关。
【关键词】 心复康；心肌梗塞；骨髓间充质干细胞；血管新生
abstract：objectiveto discuss the protective action on transplanted bmscs by chinese traditional medicine xinfukang(xfk) after rats acute myocardial infarction. methodsbmscs were cultured and purified by gradient centrifugation -adhesive method. the rats with acute myocardial infarction were built by coronary artery ligation. before transplation, bmscs were signed by brdu, and after the ops of coronary artery ligation, the therapy methode was xfk combining bmscs transplantation. after 2 weeks, we measured serum vegf by method of elisa, the albumen vegf, cell amount of brdu(+) and neonatal vessels of cd34+ around the infarct area by method of ihc. resultsthe method of xfk combining bmscs transplantation increased livability of transplanted bmscs and serum vegf(compared with group of bmscs tranplation,p<0.05), enhanced infarct area albumen vegf and neonatal vessels. conclusioncompared with simply bmscs transplantation, xfk hase better protection on the transplanted bmscs. the mechanism maybe xfk can promote the vessels regeneration of infarct area.
key words：xinfukang； myocardial infarction； bmscs； vessel regeneration
心肌梗塞是心肌的急性坏死,病情凶险,病死率较高。WWw.11665.COm目前，骨髓间充质干细胞（bmscs）移植治疗急性心肌梗塞显示了良好的应用前景 。本研究考虑，干细胞移植治疗心肌梗塞的前提首先应该是干细胞本身在移植后能够顺利的成活下来，其存活率必然影响其作用的发挥。最近，中药联合骨髓干细胞移植治疗心肌梗塞取得了令人鼓舞的进展，显示出中药在干细胞移植过程中存在的特有优势：毒副作用小，促进干细胞增殖、分化等［1，2］。故本实验采用中药心复康干预骨髓间充质干细胞移植治疗实验性大鼠心肌梗塞，以观察中药心复康对大鼠心肌梗塞后移植骨髓间充质干细胞的保护作用。
1材料
wistar大鼠，雄性，体质量150～250 g（军事医学科学院第四研究所动物实验中心）,l-dmem培养基（美国gibco公司），胎牛血清（fcs，美国hyclone公司），胰蛋白酶（difco），乙二胺四乙酸（edta，天津联星试剂公司），brdu (sigma公司)，cd44、cd34免疫组化试剂盒（天津联星试剂公司），brdu石蜡切片免疫组化试剂盒（天津市灏阳生物制品有限公司），vegf免疫试剂盒及elisa试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），中药心复康（天津中医药大学第一附属医院制剂室）。
2 方法
2.1 bmscs体外分离培养和brdu标记本实验采用密度梯度离心和贴壁筛选法培养并纯化bmscs，大鼠脱颈处死,无菌条件下取双侧股骨、胫骨,适量d-hank's液冲洗骨髓,100目筛网过滤,采用percoll分离液行密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,将密度为1.073 g/ml的percoll预先置于试管的底部,然后按照1∶1的比例沿管壁缓慢滴加骨髓悬液,1 800 r/min离心20 min,收获位于界面层灰白色的单个核细胞,用l-dmem离心洗涤2次,800 r/min离心5 min。以3.0×105/cm2的密度接种于l-dmem完全培养液,置于37℃、体积分数为0.05的co2饱和湿度培养箱中继续培养,48 h后首次换液,以后每隔3 d更换1次培养液,2周后细胞长满80%瓶底。
骨髓间充质干细胞的传代培养:将原代细胞瓶内的培养液弃去,d-hank's液冲洗2次,以去除培养液中的血清,加入2.5 g/l胰蛋白酶和0.2 g/l乙二胺四乙酸消化细胞,显微镜下观察,控制消化时间。细胞收缩变圆时,立即加入含少量血清的培养液终止消化,用弯头吸管轻轻吹打细胞,收集细胞悬液,800 r/min离心5 min,弃上清。加入完全培养液充分吹打成单细胞悬液,按1∶3传代接种于75 cm2培养瓶内,待细胞铺满瓶底后依上法传代。
骨髓间充质干细胞的鉴定:选用生长状况良好的骨髓间充质干细胞,采用sabc法检测细胞表面抗原cd44+、cd34-的细胞即为所需细胞，实验发现第3代获得bmscs的纯度超过95%［3，4］，实验用第3代细胞。
brdu标记：每日观察原代及传代的细胞生长状况,需加brdu的培养瓶中预先加入0.5 cm×1.0 cm无菌玻片,当细胞铺满瓶底50%时加入brdu溶液10 μmol/l(brdu 50 mg;二甲基亚砜0.8 ml;水1.2 ml)分别孵育24，48，72，96 h。取出玻片,用pbs冲洗,4%多聚甲醛固定15 min,进行brdu免疫组化染色（严格按试剂盒说明进行）。
2.2 动物模型制备
同基因型雄性wistar 大鼠，190～210 g，乙醚吸入麻醉。颈部正中切口，插入气管套管，行呼气末正压通气，标准肢体ii导联记录心电图。在胸部左侧约0.5 cm处第4、5肋间切开皮肤，钝性剥离肌肉层，剪开心包，暴露心脏，以左冠状动脉主干为标志，在左心耳根部下方2 mm处用无创小圆针结扎左冠状动脉前降支。手术15 min，心电图s-t段呈单向曲线，术后两周he染色见明确梗塞区示手术成功。
2.3 bmscs移植移植前
48 h在培养液中加入终浓度为10 μmol/l 的 5-溴脱氧尿核苷（brdu）对移植细胞进行标记。胰酶消化，pbs反复冲洗、离心（1 500 r/min，5 min ）2 次，加入 pbs 液调整细胞浓度为2×106/ml。治疗组手术结扎冠状动脉15 min后，再次打开胸腔，暴露心脏，用结核菌素注射器吸取1 ml细胞悬液，分别于结扎区和附近心肌组织分5点注射细胞，对照组和模型组注射相同剂量生理盐水，注射完毕后，关闭胸腔，并注射两天青霉素。
2.4 动物分组实验分为4组：假手术组（s组，n=10）,只开胸穿线，不结扎左冠状动脉前降支；模型组（ami组，n=10）：开胸结扎左冠状动脉前降支；单纯细胞移植组（b组，n=10）：手术后15 min，注射培养的bmscs；中药联合细胞移植组（x+b组，n=10）：手术后15 min移植培养的bmscs，并按体表面积法计算中药剂量的10倍（81 g·kg-1·d-1）灌胃2周。
2.5 中药制备将中药心复康（由西洋参、白术、枸杞子、女贞子、土鳖虫等组成）置于砂锅中，加入相当于药材体积5倍的自来水浸泡1～2 h，煮沸30 min，滤过药液，再加入3倍量的自来水继续煮沸20 min，过滤，合并两次滤液，将药物浓缩至200 ml备用。
2.6 指标检测
2.6.1 血清血管内皮生长因子（vegf）的检测术后2周大鼠眼眶后静脉丛采血2 ml，室温静置20 min，3 000 r/min离心10 min，离心半径为15 cm，小心吸取血清置-70℃冰箱保存待测。以酶联免疫吸附测定法（elisa）测定，严格按试剂盒说明进行，以pg/ml表示血清vegf含量。
2.6.2 血管内皮生长因子（vegf）蛋白表达用病理图像分析仪测vegf平均光密度指标判定标准:心肌组织中vegf表达:以心肌细胞胞浆内或细胞外基质出现棕黄色颗粒为阳性判定标准。免疫组化阳性反应强度,用图像分析系统进行定量分析。阳性反应强度用iod值表示, iod值=阳性反应面积/平均光密度。
2.6.3 移植细胞存活率和心肌微血管密度检测处死动物，以结扎线为标志，每隔3 mm取大鼠心脏横断面，每只大鼠心脏取材3块组织，制成切片，免疫组织化学方法检测心梗区brdu阳性移植细胞数和cd34+新生血管数（操作按试剂盒说明进行）。nikon光学显微镜400×视野下,每个组织切片随机选取10个视野,分别计算brdu阳性移植细胞数和cd34阳性的血管数量,取10个视野平均值。相互分离的内皮细胞、内皮细胞簇、内皮细胞条索均按1个微血管计数，管腔大于8个红细胞大小，且带有较厚肌层的血管则不予计数。
2.7 统计学方法所有实验数据采用spss13.0软件进行分析，采用±s表示，计量资料比较用单因素方差分析，均数比较采用t检验。
3 结果
3.1 bmscs分离和培养分离接种的细胞镜下呈圆形，大小不一，数目较多，48 h后贴壁，8～9 d后大部分细胞变成长梭形，少部分呈多角形。此期的细胞生长迅速，互相连接。传代培养2～3代后，细胞形态变得较为一致，呈纺锤形、梭形、多角形，增殖迅速，集落之间相互靠近，融合后呈漩涡状。至培养的第12天左右细胞达到80%～90%融合，此时已传至第3代，细胞形态成较一致的长梭形。将此时的细胞收集用于细胞移植实验（见图1～3）。
3.2 bmscs标记骨髓间充质细胞培养至40％～50％贴壁时加brdu，在培养过程中，bmscs呈纺锤形,可以贴壁生长、增殖。第8天,培养瓶中几乎所有的细胞都呈纺锤形的间充质干细胞。各标记组均见brdu阳性细胞, brdu阳性反应物位于细胞核,呈棕色、颗粒状或弥漫性分布。标记组可见brdu标记的细胞。未标记对照组未见阳性细胞。各组观察200个细胞,记录brdu阳性细胞的数目。结果可见标记24，48，72 h各组之间细胞阳性数明显增加,我们选用标记72 h作为最佳标记时间进行后续试验,标记率>96%,能够满足实验需要。见图4。
3.3 各组大鼠梗塞区brdu阳性移植细胞检查结果与细胞移植组比较，心复康联合细胞移植组brdu阳性细胞数有所增加（p<0.05）。见表1。表1 各组大鼠brdu阳性细胞数的比较（略）
3.4 各组大鼠血清vegf水平、心肌vegf蛋白表达和新生血管检查结果与假手术组比较，各组血清vegf水平、vegf蛋白表达及新生血管数量均升高（p<0.01）；与模型组比较，心复康联合干细胞移植组血清vegf水平、vegf蛋白表达及新生血管数量升高，（p<0.05,p<0.01）,而细胞移植组血清vegf水平与模型组无明显差别，但vegf蛋白表达及新生血管数量却有所升高（p<0.05）；与细胞移植组比较，心复康联合干细胞移植组血清vegf、vegf蛋白表达水平及新生血管数量均升高（p<0.05）。见表2。表2 各组大鼠血清vegf水平、vegf蛋白表达和新生血管数量比较（略）
4 讨论
近年来，骨髓间充质干细胞（bmscs）移植成为治疗缺血性心脏病研究的热点，既往的实验研究已探讨了bmscs的分离、纯化、体外培养扩增，细胞表面特性以及向心肌细胞转化等问题［5～6］，但bmscs在心肌损伤后缺氧条件下的特性、生存以及bmscs在缺氧或无氧条件下对心肌的修复作用和可能机制尚未完全清楚。在需要进行干细胞治疗的缺血性心脏病的微环境中，缺血缺氧及炎性环境长期存在，因此，进行细胞移植时，植入的细胞要在梗塞区内存活、定居，充足的血液供应也是必要的前提条件，成为其进一步发挥功能的前提。
vegf作为高度特异性的血管内皮细胞生长刺激因子, 能特异性地作用于血管内皮细胞,刺激其增殖,促进侧支血管的形成［7］，目前已被广泛接受。本实验采用现在已成熟的密度梯度离心和贴壁筛选法培养骨髓间充质干细胞，以brdu标记移植细胞，其标记率>96%。实验结果表明，与模型组比较，bmscs组大鼠血清vegf水平没有明显差别，但其心肌损伤区vegf水平提高及cd34阳性新生血管数量增加，可能与bmscs旁分泌作用或其能分化为新生的血管内皮细胞，直接促进血管新生有关［8～9］；与bmscs组比较，心复康联合干细胞移植组能上调心梗大鼠血清vegf水平，增强心肌损伤区vegf蛋白表达，增加新生血管数量，增加移植细胞的生存数量，表现出心复康对移植bmscs存在一定保护作用，可能与心复康能上调心梗大鼠细胞因子vegf表达，促进内皮细胞增生，促进心肌损伤区血管新生，改善损伤区及移植细胞血供有关。
心肌梗塞属于中医的“胸痹”“厥心痛”的范畴。《金匮要略》认为胸痹心痛的病机为“阳微阴弦”本虚标实。中药复方心复康以益气养阴，活血化淤为根本大法，方中西洋参甘寒之品，补气养阴、清火生津；鹿衔草甘温补阳，微补肾阳、健脾理气；女贞子辛苦清凉，补中有清，滋而不腻，为补益肝肾之良药；丹参擅长活血化淤，为活血化淤的常用药；川芎味薄而气清，为阴中之阳，故能行血中之气；土鳖虫具破血逐淤之力，其力猛而性温和。全方扶正祛邪，调和气血运行，从而使正胜邪去，气血盈畅，达到病去人安。我们的实验证实心复康对移植bmscs存在一定保护作用，其机制可能与促进心肌损伤区血管新生有关，这一结果为中药联合bmscs移植治疗心肌梗塞提供了一定的实验依据。
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