【摘要】  目的观察中药熏蒸疗法对ii型胶原诱导型关节炎（cia）大鼠关节滑膜细胞il-1β mrna表达水平的影响，以探讨中药熏蒸疗法治疗类风湿性关节炎（ra）的机理。方法建立cia模型，将雄性wistar大鼠40只随机分为正常组、模型组、水熏组、低熏组、高熏组，观察各组大鼠膝关节滑膜细胞il-1β mrna的表达。结果熏蒸各组大鼠滑膜细胞中il-1β mrna的表达量明显低于模型组，具有非常显著差异（p＜0.01）；而各熏蒸组组间比较，高、低熏组明显低于水熏组，均有非常显著差异（p＜0.01）；高熏组明显低于低熏组，亦具有显著差异（p＜0.01）。结论中药熏蒸疗法能明显抑制cia大鼠滑膜细胞il-1β mrna表达，并推测中药熏蒸疗法抗炎机制与其抑制il-1β的表达相关。

【关键词】  中药熏蒸疗法； il-1β； mrna； cia大鼠； 类风湿性关节炎

　　abstract:objectiveto explore the therapeutic mechanism of the chinese herb fumigation and steaming therapy for rheumatoid arthritis(ra) by observing the effects of the chinese herb fumigation and steaming therapy on expression of mrna of il-1β in synoviocytes from collagen-ii induced arthritis(cia) rats.methodsto duplicate cia model,the 40 male wistar rats were randomized into normal group，model group, water group，high dose group and low dose group,the expression of mrna of il-1β in synoviocytes from the cia rats were observed.resultsafter fumigation, the expression of mrna of il-1β in synoviocytes were significantly lower than that of model group (p<0.01).in comparison among the fumigation groups,the high dose group and low dose group were significantly lower than that of water group (p<0.01), the high dose group were significantly lower than that of lower group(p<0.01).conclusionthe chinese herb fumigation and steaming therapy can lower the expression of mrna of il-1β in synoviocytes from cia rats,and the anti- inflammatory mechanism maybe associated with its effect in inhibiting the expression of mrna of il-1β.

　　key words:the chinese herb fumigation and steaming therapy；  interleukin-1；  messenger rna；  cia rats；  rheumatoid arthritis
   
　　类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,ra)是一种以慢性破坏性关节病变为特征的全身性自身免疫病［1］。WwW.11665.Com其病因及发病机制尚未完全明确，但大量研究证实，ra滑膜细胞及滑膜组织中浸润的单核/巨噬细胞、淋巴细胞等产生的细胞因子在ra滑膜病变中起核心作用,在相关细胞因子中，尤其以il-1β在ra的发生发展中起着重要的作用。我们运用中药熏蒸疗法治疗ra，在长期的临床实验观察中取得了良好的疗效。本研究采用半定量rt-pcr进一步研究中药熏蒸疗法治疗ra的分子免疫学机理。

　　1  材料与仪器

　　1.1  动物健康清洁级雄性wistar大鼠40只，体质量(80±20)g，广州军区广州总医院实验动物中心提供。

　　1.2 药物熏蒸1号方（含羌活20 g，独活20 g，防风15 g，桂枝15 g，细辛10 g，川芎20 g，海风藤30 g，徐长卿30 g，姜黄20 g，苏木20 g，冰片1 g），由广州军区广州总医院中药房提供。熏蒸方中前10味中药由自动煎药机煎煮成53.3%浓度的中药液保存，熏蒸治疗时按高低浓度分别稀释成6.67%和3.33%浓度的中药液，冰片待熏蒸治疗前加入中药液中。

　　1.3  中药熏蒸治疗设备自制动物熏蒸装置；电子恒温三用水箱，广东省汕头市医用设备厂产品，型号hh·w21·cr42ii；t型管足肿测量仪（自制）。

　　1.4 试剂小牛源ii型胶原，广州威佳生物科技有限公司提供，chondrex公司产品；弗氏不完全佐剂，广州威佳生物科技有限公司提供，calbiochem公司产品；大鼠il-1β、il-1ra的elisa检测试剂盒，武汉中美科技有限公司提供，sigma公司产品；大鼠il-1β的rt-pcr检测试剂盒，武汉中美科技有限公司提供，promega公司产品；trizol reagent，美国invitrogen公司；depc，美国sigma公司；eb(溴化乙锭)，美国sigma公司；dna分子量标准，宝生物工程（大连）有限公司。

　　1.5 仪器pcr扩增仪，biometra公司；水平电泳仪，bio-rad公司；3k30型台式高速冷冻离心机，sigma公司；fm70制冰机，grant公司；微量有机分析专用超纯水机，颐洋企业发展有限公司；超低温冰箱，forma scientific公司；ld2x-40ci型立式自动电热压力蒸气灭菌器，上海申安医疗器械厂；超净工作台，苏州净化设备有限公司；紫外分光光度计，biometra；凝胶成像系统，syngene；dhg-91401型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；低温离心机，美国beckman公司产品；leica－rm2245型组织切片机；lt2－12550酶标仪，澳大利亚biocell公司产品；nikon－e600显微镜，彩色摄象机，北京杰伟世音设备有限公司组装；电子天平ja2003，上海天平仪器厂；酶标仪，biocecc htz，编号54809；生化培养箱，广东省正一科技有限公司，型号pyx-250s-b。按照文献合成引物，由上海生工生物技术有限公司合成il-1β引物:正义链:5’-ctcgcttgagaggtgctgatggtac-3’,反义链: 5’-gaagctgtggcagctacctatgtct-3’,扩增产物长度:519 bp;β-actin: 正义链: 5’-ttccagccttccttcctgg-3’,反义链: 5’-ttgcgctcaggaggagcaat-3’,扩增产物长度:226 bp。

　　2 方法

　　2.1  cia大鼠模型复制和分组治疗将40只大鼠随机留取8只作为正常组，其余32只待造模，适应性喂养3 d。取10 mg小牛源ii型胶原溶于配制好的0.1 mol/l乙酸5 ml，然后放置4℃冰箱内过夜，次日按2 mg/ml比例与弗氏不完全佐剂1∶1混合，用注射器反复抽吸,直至混合物完全、充分乳化，以乳化物滴入水中不松散为度（在冰浴中操作）；取乳化后大鼠cia造模剂，于大鼠尾根部及左足底皮内按0.5 ml/只注射,并轻微压迫注射部位30 s，以使乳化物吸收完全。注射后第1天，部分造模组大鼠注射区局部皮肤发红、轻度肿胀、皮温升高，活动欠灵活；第2日部分造模大鼠左后足肿胀继续加重，并于3～7 d开始逐渐消退；至第8日按以上同样的方法再次注射0.3 ml/只，注意需避开上次注射部位；第14日大部分造模大鼠左后足和部分右后足关节出现肿胀、皮肤发亮、充血及关节活动受限；第21日大部分双后足关节及部分前足关节肿胀达到高峰，部分大鼠出现皮肤溃疡。多发性关节炎的出现表明大鼠cia模型建立成功。造模后第21天，32只模型大鼠随机分成4组，模型组、水熏组、低熏组、高熏组各8只。正常组和模型组常规喂养，不做熏蒸处理；水熏组给予(57±1)℃蒸馏水熏蒸，蒸气温度为（39±1）℃；低熏组给予相同温度3.33%的中药液熏蒸；高熏组给予相同温度6.67%的中药液熏蒸。将大鼠放入自制动物熏蒸装置，开启电子恒温水槽，待蒸气温度达到熏蒸要求时，开始熏蒸并计时，熏蒸20 min/次，连续20 d。

　　2.2  大鼠滑膜细胞的获取、细胞因子mrna的诱生和总rna的抽提造模后第41天，以自配麻醉剂（5%盐酸氯胺酮注射液20 ml，2.5%盐酸异丙嗪注射液20 ml、0.05%硫酸阿托品注射液10 ml混匀），于每只大鼠腹腔注射0.6～0.8 ml，迅速麻醉，麻醉后心腔取血，后以颈椎脱臼法处死，取膝关节滑膜组织，液氮下保存待测，之后进行大鼠滑膜细胞总rna的提取，其步骤如下：

　　2.2.1  匀浆取100 mg大鼠滑膜组织置于盛有适量液氮的碾钵中充分碾磨，每100 mg组织加1 ml的trizol，颠倒ep管数次混匀，室温放置5 min，4℃ 12 000 r/min离心10 min，将上清移入另外一个离心管中，匀浆时组织样品容积不能超过trizol容积的10%。

　　2.2.2  分离将匀浆样品在15～30°c条件下孵育5 min以使核蛋白体完全分解，每毫升trizol加0.2 ml氯仿，盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15 s并将其在30℃下孵育2～3 min，在2～8℃下以不超过12 000 r/min的离心力高速冷冻离心15 min，离心后混合物分成3层：下层红色的苯酚-氯仿层、中间层、上层无色的水样层，rna无一例外地存在于水样层。

　　2.2.3  沉淀将水样层转移到一干净的试管中，如果希望分离dna和蛋白，有机层同样要予以保留。通过将水样层和异丙醇混合来沉淀rna，最初均化时的每毫升trizol对应0.5 ml异丙醇，将混合的样品在15～30℃条件下孵育10 min并在2～8℃下以不超过12 000 r/min的离心力高速冷冻离心10 min，rna沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。

　　2.2.4  洗脱移去上层悬液，用75%乙醇洗涤rna沉淀一次，每毫升的trizol至少加1 ml的75%乙醇，漩涡振荡混合样品并在2～8℃下以不超过7 500 r/min的离心力高速冷冻离心5 min。

　　2.2.5  再溶解简单干燥rna沉淀，尤为重要的是不能让rna沉淀完全干燥，那样会极大地降低它的可溶性，用移液管尖分几次移取无rna酶的水来溶解rna，于-70℃保存。

　　2.2.6  总rna的琼脂糖凝胶电泳①电泳rna所用器械如制胶的模具、梳子、电泳槽等用肥皂粉洗干净后用双蒸水冲洗两遍后在室温晾干备用。②用新的1×tbe配制1.2%琼脂糖凝胶,倒胶时溴化乙锭(eb)直接加入凝胶中。③制备好的琼脂糖凝胶板放入电泳槽后再加入经高压灭菌过的1×tbe，液面只能刚好同胶面平齐，缓冲液不要淹过胶面。④点样时，样品rna每10 μl加入2 μl上样缓冲液，上样缓冲液是用depc处理的水配制的50%甘油，另外单独点一样品孔含有3 μl溴酚蓝的上样缓冲液作为电泳指示剂，电泳电压4 v/cm，电泳时间2 h左右便可取出凝胶在紫外灯下观看所提取的rna的质量,同时进行拍照记录。

　　2.3  半定量rt-pcr（参照试剂盒说明进行）

　　2.3.1  逆转录10 mmolldntp2ul、rnase抑制剂20u、逆转录酶50u、50 μmol/l随机引物1 μl,25 mmol/l mgcl2 4 μl、10×pcrbuffer 2 μl、总rna 2 μl、总体积20 μl,置37℃水浴箱反应40 min。 

　　2.3.2  pcramli-taq多聚酶2.5 u、15 μmol/l tnf-α正义链和反义链引物各1 μl,15 μmol/l b-actin正义链和反义链引物各1 μl蒸馏水63.5 μl,与逆转录反管混合,终体积为100 μl。扩增条件为:

    β-actin  94℃2 min   94 ℃ 30 s  58℃ 30 s   68℃ 2 min   40个循环后68℃ 7 min
    il-1β  94℃2 min   94 ℃ 30 s  64℃ 30 s   68℃ 2 min   40个循环后68℃ 7 min
   
　　取10 μl pcr产物在2%琼脂糖凝胶上电泳,溴乙淀染色,在紫外检测仪上观察结果并照像,用图像分析仪(英国uvp产品)对底片条带进行扫描,计算tnf-a产物与b-actin产物的比值,以此比值来反映细胞因子mrna量的变化。

　　2.4  统计学处理组间均数比较采用双侧t检验。

　　3  结果

　　3.1  总rna完整性的鉴定图1结果显示，取cia模型大鼠膝关节滑膜组织rna3 μg和6 μg，按前述方法以1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳，可见28s、18s、5.8s（5s）3条清晰的rrna条带，经用rnasea酶消化的样品条带消失，表明提取物确为rna。在电泳后能观察到28s、18s、5.8s(5s)，特别是28s清晰的带型，通常认为所提取的rna未被降解，可以用提取的rna进行后续实验。

　　3.2  cia大鼠滑膜细胞il-1β mrna表达水平

　　表1结果显示，各造模组il-1β的mrna在滑膜细胞上均有表达，造模各组与正常组比较有非常显著差异（p＜0.01）；各熏蒸组与模型组比较亦具有非常显著差异（p＜0.01）；而各熏蒸组组间比较，高、低熏组与水熏组比较均有非常显著差异（p＜0.01）；高熏组与低熏组比较亦具有显著差异（p＜0.01）。

　　3.3  中药熏蒸疗法对cia大鼠滑膜细胞il-1β mrna表达的影响

　　表1和图2结果表明，正常组见非常微弱条带，模型组在519 bp处可见有一清晰的电泳带，基因表达最强，与预期的il-1β mrna基因片段长度相符。低熏组和水熏组可见有较弱的电泳条带，高熏组在519 bp处条带最弱，基因表达回落说明中药熏蒸疗法能显著抑制cia大鼠滑膜细胞异常升高的il-1β mrna的表达,使其趋于正常(p<0.01)； 低熏组和水熏组对cia大鼠滑膜细胞il-1β mrna的表达也有一定的下调作用(p<0.05)；但模型组却进一步上调了cia大鼠滑膜细胞il-1β mrna表达(p<0.05)。表1  中药熏蒸疗法对cia大鼠滑膜细胞il-1βmrna表达的影响（略）

　　4  讨论

    ra是一种以关节滑膜炎为特征的慢性自身免疫功能障碍性疾病，ra发病时,滑膜细胞胞核染色体的il-1β基因转录相应的mrna迅速增加,刺激b细胞和t细胞释放的细胞因子和抗体亦增加,同时刺激滑膜细胞释放更多细胞毒素,从而导致关节软骨和骨侵蚀,促进关节破坏进行性发展；因此有效抑制ra滑膜细胞il-1β mrna的异常表达,降低il-1β的产生,是ra治疗的可取途径。

    ra属中医的“痹证”范畴，中医理论认为,“风寒湿三气杂至，合而为痹也。其风气胜者为行痹，寒气胜者为痛痹，湿气胜者为着痹也”，或因劳累闪挫，气滞血淤，使邪气留滞经络，或停留于身体某个部位，使气血运行不畅，筋脉关节失于濡养，从而引起肢体、关节的疼痛、酸楚、麻木以及活动障碍［2］，治疗以祛风散寒除湿，活血化淤通络为主，以此理论为指导,我们依据疾病治疗的需要，选配一定的中药组成熏蒸方剂，将中药煎液趁热在皮肤或患处进行熏蒸、熏洗，借助药力和热力通过皮肤而作用于机体，而达到治疗效果，我们称之为“中药熏蒸疗法”。实验研究所采用的熏蒸1号方为广州军区广州总医院中医科沈鹰教授根据多年临床经验的总结。以往的研究表明,运用熏蒸1号方对ra进行中药熏蒸治疗，具有良好的临床治疗效果，无毒副作用，能降低aa模型大鼠血清炎性因子no、pge2、il-1β、tnf-α及icam-1的含量，抑制关节骨质破坏［3,4］。本研究采用目前公认的ra的最佳模型，即cia大鼠模型，运用半定量rt-pcr方法，进一步研究了中药熏蒸疗法对滑膜细胞il-1β mrna表达的影响,力图从细胞因子角度为中药熏蒸疗法治疗ra提供部分理论基础。
   
　　结果表明，中药熏蒸疗法能明显抑制cia大鼠滑膜细胞il-1β mrna表达，使其趋于正常，提示中药熏蒸疗法治疗ra取得良好疗效,在il-1β的产生等一系列环节中起到阻抑作用可能是其作用机制之一；此外，蒸馏水熏蒸也在一定程度上降低了cia大鼠滑膜细胞il-1β mrna表达，表明蒸气的温热作用在熏蒸治疗中具有重要的治疗作用，现代大多数医家都认为熏蒸疗法是以药物和蒸气的温热作用共同作用于人体而起治疗作用的［5］。因此,蒸气的温热作用也是中药熏蒸疗法治疗ra能有显著疗效的重要因素之一。

【参考文献】
  　［1］王吉耀.内科学，第1版［m］.北京：人民卫生出版社，2006：1052.

　　［2］沈鹰.风湿病中西结合诊疗概要［m］.北京：人民军医出版社，2006：41.

　　［3］汪元,沈鹰.中药熏蒸对关节炎大鼠抗炎消肿作用及炎性递质的影响［j］.安徽中医学院学报，2006，25（1）：22.

　　［4］陆继娣,沈 鹰.中药熏蒸对佐剂性关节炎大鼠血清踝关节中icam-1的影响［j］.山东中医药大学学报,2008,32(3):242.

　　［5］郭郡浩,陈林囡,李 华.中药熏蒸疗法研究近况［j］.时珍国医国药,2000,11(10):948.