作者：廖敏，于秀霞，阮期平，杨慧，汤泽生，罗英 

【关键词】  航天诱变; 凤仙花; 抗菌肽; 分离纯化

抗菌肽(antimicrobial peptides，amps)，是生物界中广泛存在的一类生物活性小肽，具有抗细菌或真菌作用，有些还具有抗原虫、病毒或肿瘤细胞的功能［1］。抗菌肽具有广谱的抗菌作用，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌具有抑制作用；可以杀伤动物体内的肿瘤细胞，却又不破坏动物体内的正常细胞［2，3］。因此，抗菌活性肽的开发与应用研究已成为国内外昆虫学、植物学、生理学、药理学研究的热点。
   
　　凤仙花是一种较早开发的药用植物。中医认为, 凤仙花子能通经活血、软坚散结；根叶有散血通络、祛风止痛、解毒疗疮之功效。近年来，研究发现凤仙花还有抑菌、消炎和抗癌等作用。本试验采用的材料是普通凤仙花种子搭载“神舟四号”航天飞船绕太空运行6天18小时后播种，由凤仙花航天突变植株获得的第四代种子(sp4)。研究［4～7］证实航天诱变凤仙花种子，由于宇宙射线、交变磁场、微重力和高真空等因素的影响，其染色体出现了大规模不规则变异，可能导致基因突变，从而影响植物体内蛋白质的合成。因此，航天诱变凤仙花抗菌肽的分离、纯化具有重要的研究价值，对航天诱变育种、抗菌肽的大量生产以及抗菌药物的开发等具有实际意义，在国内外尚属首次。wwW.11665.cOm

　　1  材料
   
　　航天诱变凤仙花种子(sp4)由西华师范大学生命科学学院汤泽生教授提供。
   
　　供试菌株：枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)和大肠杆菌(escherichia coli)由实验室保存；金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)购自于中国科学院微生物研究所菌种保存中心，绿脓杆菌(p.aeruginosa)由四川省绵阳市第三人民医院呼吸科提供。

　　2  方法

　　2.1  粗提物的收集及抑菌作用称取适量航天诱变凤仙花干种子，磨成粉末，采用磷酸缓冲液于4℃冰箱浸提24 h后离心取上清液。沉淀反复浸提数次，合并上清液，于4℃采用硫酸铵（80%饱和度）盐析收集沉淀的蛋白质，并透析脱盐，获得种子总蛋白质。
   
　　将种子总蛋白溶液用枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌做抑菌实验。

　　2.2  抗菌肽的初步纯化采用millipore小型切向流超滤系统对脱盐后的蛋白质进行初步分离，选用使用截留量为50 kd，10 kd和5 kd的膜包经过3次分级分离，获得了抗菌肽粗提物。
   
　　将上述各提取物上样c18柱，以99.9%乙腈和0.1%三氟乙酸tfa为洗脱液，以3.0 ml·min-1的流速进行洗脱，紫外检测仪器检测其od210处的吸光值。收集具有抑菌活性的样品冷冻真空干燥至粉末，－20℃保存。
   
　　同时参考孙雪文等［8］的方法，采用改进的tricine-sds-page电泳系统检测每步产品的分子量并进行抑菌试验。

　　2.3  抗菌肽的纯化用0.2 μm的一次性滤头对超滤分离出来的分子量小于5 kd的小分子蛋白质样品进行过滤，除去不溶性杂质。再采用安捷伦c18制备柱进行抗菌肽的纯化，流动相99.9%乙腈与0.1%三氟乙酸tfa，流速3.0 ml·min-1，柱温23℃。用紫外检测器在波长为210 nm下测紫外吸收值。收集各峰，冷冻真空干燥至粉末。将冻干品稀释后做抑菌试验，有抑菌活性的峰就含有抗菌肽。

　　2.4  抗菌肽抑菌活性的测定采用纸片法来进行抑菌活性检测。细菌培养基为lb固体培养基。菌种为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌。在直径为10 cm的平皿内倾倒培养基；待平板冷却，吸取调整好浓度的，处于对数生长期的供试菌悬液100  μl于平板上，用无菌涂布器均匀涂布于平板表面。每种供试菌涂布两个平板，每个平板贴4张直径为6 mm的无菌纸片，其中两片加滴加20 μl抗菌肽样品，另外两片滴加无菌水作对照。在37℃培养24 h(绿脓杆菌和枯草芽孢杆菌的培养温度为24℃)，测量各抑菌圈直径，以表示抗菌活性。

　　2.5  抗菌肽的电泳检测以分子量73，50，35，25，16，8，2 kda蛋白质为标准蛋白。因此本课题组参考孙雪文等［8］的方法，采用改进的tricine-sds-page电泳系统，对提取的小分子多肽的分子量进行检测。

　　3  结果

　　3.1  蛋白质粗提结果由图1可以看出，蛋白质粗提物中含有多种蛋白质，其中在29 kd附近存在有染色较深的条带，说明粗提物中含有小分子蛋白质，且含量较高。图1中条带2～5是第1次超滤，用50 kd的膜包截留得到的分子量小于50 kd的蛋白质。

　　3.2  抗菌肽超滤初步纯化结果经过超滤对种子总蛋白质进行初步分离，得到的分子量小于5 kd的小分子蛋白质样品进行电泳检测，分别用考马斯亮蓝和硝酸银染色法对凝胶进行染色，在2 kd左右都可以清楚的看到一条清晰的小分子蛋白质条带，在图上还出现了8 kd以上的蛋白质条带，这是由于5 kd超滤膜在截留的过程中，在压力的作用下，5 kd的膜包可以通过3倍分子量以上的蛋白质。

　　3.3  抗菌肽纯化结果对超滤得到的小分子蛋白质采用高效液相再进行分离纯化。
   
　　①首先采用c18制备柱来分离分子量小于5 kd的蛋白质，根据峰的情况，分段搜集分离出来的物质，冻干，溶于无菌蒸馏水中。经过tricine-sds-page电泳和抑菌活性鉴定后发现，搜集的a-b段在2 kd左右有条带，也具有抑菌活性。由于超滤分离出来的小分子蛋白质杂质太多，需要进一步纯化a-b段物质。
   
　　②按照高效液相第1次制备的方法对搜集的a-b段进行再纯化，结果见图2，可知第2次分离制备的蛋白质相对较纯，杂质含量少。搜集主峰，然后进行电泳及抑菌活性检测，检测发现主峰分子量在2kd左右，且具有抑菌活性。

　　3.4  电泳检测结果对高效液相制备过程中，各步骤产品冻干粉溶解，进行电泳鉴定其分子量。结果见图2。电泳检测说明此从航天诱变凤仙花种子中提取的物质分子量在2kd左右，带型清晰，紧凑，结果非常理想。

　　3.5  抑菌活性检测结果与分析抑菌实验结果见表1。结果表明，从航天诱变凤仙花种子中提取出的低分子量蛋白质对金黄色葡萄杆菌、绿脓杆菌有明显的抑菌作用，且抑菌作用持续时间较长；分别观察48 h和72 h后，抑菌圈没有被感染。对大肠杆菌抑菌效果不太明显，抑菌圈较小，对枯草芽孢杆菌几乎没有抑菌作用。表1  抗菌肽抑菌实验结果（略）

　　4  讨论
   
　　本实验选用动物源性金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、大肠杆菌(escherichia coli)、绿脓杆菌(p.aeruginosa) 和植物源性枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis) 4种菌株来做抑菌试验，发现提取的低分子量蛋白质对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌有明显的抑菌作用，但对大肠杆菌的抑菌作用比较弱，对枯草芽孢杆菌的抑菌作用不明显。在接种的过程中发现，随着低分子量蛋白质溶液量的增加，抑菌圈从无到有，从小到大，因而证明种子中确实存在具有抗菌作用的分子量大约2 kd左右的小肽，即抗菌肽。但是其抗菌机制和抗菌谱还需要进一步研究建立。
   
　　通过对航天诱变凤仙花种子总蛋白质的粗提、分离和纯化，经电泳获得了分子量在2 kd左右的具有抗菌活性的小分子蛋白质，推测航天诱变的凤仙花种子中存在抗菌肽。1997年，tailor等首次从凤仙花种子中分离出4种对真菌和细菌表现出宽范围的抑制作用，而对培养的人细胞没有毒性的肽-ib-amp1、ib-amp2、ib-amp3、ib-amp4，而本实验室分离纯化出来只有一种小肽。一方面说明，航天诱变凤仙花种子中抗菌肽的基因可能已经发生了改变，另一方面也可能由于这4种基因编码的小肽分子量接近，在电泳时不易分开，要想彻底弄清该基因是否发生了突变还有待于进一步深入研究。
   
　　本实验表明，从航天诱变凤仙花种子中直接分离纯化小分子抗菌肽，由于材料比较少、分离纯化过程繁琐、成本高、不易检测以及容易失去活性等。因此，要获得大量抗菌肽进而研究其抗菌机制、理化性质、分子结构等，还需要采用基因工程技术构建cdna文库和抗菌肽基因工程菌，为筛选抗菌肽基因和大量生产抗菌肽奠定基础。
   
　　目前，凤仙花抗菌肽对绿脓杆菌的抑菌活性并未见报道。绿脓杆菌是是伤口感染较常见的一种细菌，能引起化脓性病变其致病力较低但抗药性强。通过本实验发现，航天诱变凤仙花种子中纯化出的小肽对绿脓杆菌具有较强的抑制作用，为以后开发肽类抗生素、特别是针对耐药性细菌的药物具有重大意义。同时也表明，在诱变的凤仙花种子中，抗菌肽的基因可能发生了突变，这种突变有可能增强了抗菌肽的活性，对以后研究诱变育种具有重要的应用价值。

【参考文献】
  　［1］胡云龙, 赵学忠, 屈贤明. 抗菌肽的分子生物学研究进展［j］. 生物工程进展, 1997, 17 (3): 14.

　　［2］李恩民, 刘维全, 殷 震. 抗菌肽的特性及其应用前景［j］. 中国药理学通报, 1998, 14 (3): 209.

　　［3］marshall sh, arenas g. antimicrobial peptides: a natural alternative to chemical antibiotics and a potential for applied biotechnology［j］. electronic journal of biotechnology, 2003, 6(2): 1542.

　　［4］汤泽生, 杨 军, 赵 燕,等. 航天诱变凤仙花sp1代花、果实和种子的研究［j］. 西华师范大学学报(自然科学版), 2005, 26(1): 47.

　　［5］李海涛, 汤泽生, 彭正松, 等.航天诱变凤仙花sp1代多分孢子现象的回归分析［j］. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2005, 33(3): 79.

　　［6］赵燕, 汤泽生, 杨 军, 等. 航天诱变凤仙花小孢子母细胞减数分裂的研究［j］. 生物学杂志, 2004, 21(6): 32.

　　［7］汤泽生, 杨 军, 赵 燕, 等. 航天诱导的凤仙花突变株性状及减数分裂过程的研究［j］. 核农学报, 2004, 18(4): 289.

　　［8］孙雪文, 周金燕. 有效分离1kda 分子量环脂肽的电泳方法［j］. 生物技术, 2005, 15(6): 47.