【摘要】 目的制备蚂蟥冻干粉针并建立其质量控制方法。方法筛选赋形剂的种类和用量，得出最佳处方和制备工艺；以高效液相色谱（hplc）法测定蚂蟥多肽（whitmanin）的含量，并以此作为主要指标考察制剂质量。另通过长期实验考察其稳定性。结果使用5％甘露醇作为赋形剂效果较好；含量测定中平均加样回收率为99.8％（rsd = 1.8%）；其室温留样12个月稳定性良好。结论所制蚂蟥冻干粉针处方合理，制备工艺可行，质量可控。
【关键词】 蚂蟥； 冻干粉针； 蚂蟥多肽； 制备工艺
study on the preparation technique and quality of mahuang freeze-dried sterile injection powder
zhong shan, yang depo, cui zheng
（school of pharmacological sciences, sun yat-sen university, guangzhou 510080, china; school of traditional chinese materia medica, shenyang pharmacological university, shenyang 110016, china）
abstract：objectiveto prepare mahuang freeze-dried sterile injection powder and establish a quality control for this drug. methodsthe best formulation and preparation technique of the powder for injection was optimized by screening the variety and quantity of whitmanin.the contents, which were determined by hplc, were taken as the main indexes to study the quality. the stability was observed through test. resultstaking the 5% mannitol as excipient,the mean recovery result was 99.8% (rsd = 1.8%), and the preparation was stable after 12 months storage at room temperature.conclusionthe formulation is reasonable, the preparation technique is feasible and the quality is controllable.
key words： leech; sterile injection powder; whitmanin; preparation technique
蚂蟥（whitmania pigra whitma）是中药水蛭的药材之一，在我国大多数地区，是商品水蛭中最常见的一种。wWW.11665.cOM本课题组前期对蚂蟥药材中的抗凝血活性成分进行了追踪分离，得到了系列抗凝活性物质，其中活性最强的物质命名为蚂蟥多肽（whitmanin），可作为蚂蟥抗凝活性的指标成分［1，2］。由于水蛭注射液具有显著的抗凝、溶栓作用，且疗效确切，因此，其作为医院制剂在临床上广泛应用。然而，注射液（水针剂）虽然起效快，但在储存过程中易出现成分降解和析出沉淀的现象，注射用灭菌粉针则无此类情况，而且水蛭制剂所使用的水蛭基源混乱，质量标准不完善，直接影响临床使用，因此，笔者选择了水蛭商品市场中最常见的蚂蟥为原料，制备了蚂蟥冻干粉针，并建立了其质量控制方法。
1 仪器与材料
岛津lc－10at高效液相色谱系统，包括spd－10a紫外检测器和anastar色谱工作站；whitmanin对照品，本研究室自制（纯度 > 98%）；蚂蟥药材（长沙县医药公司提供，经沈阳药科大学崔征教授鉴定）；乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 蚂蟥有效成分的提取采用正交实验总结出以下提取精制工艺［3］：取蚂蟥药材，粉碎后加4倍量40%的丙酮，常温浸渍提取4次，24 h/次；提取液浓缩后先用60%乙醇沉淀除去杂质，再用85%的乙醇沉淀出抗凝血活性组分；85%乙醇沉淀经真空干燥，得活性部位。
2.2 蚂蟥冻干粉针的制备工艺
2.2.1 剂量及冻干体积的确定2005版《中国药典》对3个品种水蛭的剂量均规定为1.5～3 g；本研究组药理实验结果也证明蚂蟥在该范围内安全有效［4］，因此本研究的蚂蟥冻干粉针的剂量定为每支相当于蚂蟥药材2 g。
取蚂蟥活性部位5份，每份约120 mg（相当于原药材2 g），分别用注射用水稀释至1，2，3，4和5 ml，轻轻振摇，使其溶解，观察本品的溶解情况和溶液状况。除体积为1 ml的样品水溶液相对较粘稠外，其它各体积的样品水溶液均表现为粘稠度小、澄清度高。考虑冻干制剂的制备工艺和临床用药的方便，以及配制药液的溶剂的体积应在满足装量差异要求、溶解规定剂量主药以及使冻干产品复溶性好的前提下尽可能小的原则，确定冻干体积为2 ml。
2.2.2 赋形剂种类和用量的筛选冻干制剂的制备工艺关键在于赋形剂种类和用量的选择，单独用蚂蟥活性部位水溶液进行冻干，坍塌严重，而且色泽棕黄，但再溶解性和澄明度均良好，所以作者筛选了甘露醇、乳糖、氯化钠、葡萄糖、磷酸氢二钠等5种价廉易得、应用广泛的赋形剂。分别称取5种赋形剂适量，加入适量注射用水，配制成一定浓度的溶液，微孔滤膜滤过，备用；量取微孔滤膜滤过后的蚂蟥精制液5份，分别加入不同的赋形剂溶液，每组3个比例，使最终浓度为相当于蚂蟥药材1 g/ml，以外观、色泽、溶解性、溶液的澄明度、ph值等指标考察处方的合理性。结果用甘露醇作为支持剂的样品形态饱满、疏松细腻、色泽均匀、物料体积不变、溶解性好、溶液澄明，且ph值在冻干前后无明显变化。所以选定甘露醇作为本冻干制剂的赋形剂。
甘露醇在注射剂中的用量范围是1%～10%。本实验分别加入1%～10%的甘露醇至澄明的蚂蟥活性部位水溶液中，每支2 ml分装，预冻，冻干，考察甘露醇用量对制剂的影响，结果表明支持剂甘露醇用量大，则粉针成型性、色泽好，但用量过小或过大，成型性就差些，因此确定甘露醇的用量为5%。
2.2.3 预冻液ph值的确定注射剂的ph范围为4～9。根据上述结果，选定处方，将蚂蟥活性部位加入甘露醇，配备预冻液。并在4～9之间调节成不同ph值，每支2 ml罐装，预冻，冻干，结果表明预冻液的ph值对制剂的成型性和外观色泽影响不大，但再溶解性和澄明度在ph值 > 6时不合格。为了对有效成分进行进一步的保护，每支加入0.9%的氯化钠，结果制剂的成型性、再溶解度和澄清度在ph值到达ph值 ≤7时均合格。
由以上实验的结果可以确定蚂蟥冻干粉针的处方为：蚂蟥活性部位120 g，甘露醇100 g，氯化钠18 g，加注射用水至2 000 ml，均匀混合，调节ph值至（6.0 ± 0.5），滤过，分装1 000瓶蚂蟥注射液。
2.2.4 冻干优化将本品置于－70℃冻干机中，待其冷却至－50℃以下，再预冻6 h，抽真空8 h，然后缓慢升温至－18℃左右（本制剂的最低共熔点为－18℃），再以6℃/h的速度升温至35℃，保温干燥2 h，即得。此冻干曲线在不同的机器上要做一定的调整，以得到最佳的冻干效果。
2.3 蚂蟥冻干粉针的含量测定
2.3.1 测定波长的选择分别取whitmanin和甘露醇的水溶液，在200～400 nm的波长范围内进行紫外扫描，结果甘露醇溶液在此范围内无吸收，对样品测定无干扰，whitmanin水溶液在220 nm和 280 nm波长处有吸收峰。因220 nm处存在末端吸收，因此选择280 nm作为检测波长。whitmanin的扫描图谱见图1。
2.3.2 对照品溶液的制备
精密称取whitmanin对照品适量，加重蒸去离子水配制成 1 mg·ml-1的溶液，作为对照品储备液。
2.3.3 色谱条件与系统适应性实验色谱柱为hypersil－c18（200 mm × 4.6 mm，5 μm，300 。a）（依利特公司，大连）；流动相为乙腈-水（2∶98），加入0.03%的kh2po4，再用36%的醋酸调ph值3.80；检测波长280 nm；流速1.0 ml·min-1；柱温35℃；进样量20 μl。理论塔板数按whitmanin计算不低于4 000，whitmnin与相邻峰的分离度大于1.5。whitmanin对照品和蚂蟥冻干粉针的hplc图谱见图2。
2.3.4 方法可行性研究
标准曲线与线性关系考察：取“2.3.2”项下对照品溶液，用重蒸去离子水稀释成浓度为0.186，0.371，0.561，0.743，0.942 mg·ml-1的系列溶液，依“2.3.3”项进样。以whitmanin峰面积为纵坐标（a），whitmanin质量浓度（mg·ml-1）为横坐标（c），绘制标准曲线，得回归方程：a = 2.266 × 106 c－5.429 × 103，r = 0.999 5。说明在0.186～0.942 mg·ml-1内线性关系良好。
加样回收率实验：取已知含量的冻干粉针6份，分别置于2 ml容量瓶中，加少量水溶解后稀释至刻度，摇匀。分别向6个容量瓶中按高、中、低3个浓度分别加入对照品，加入量分别相当于注射液中whitmanin含量的80％，100％和120％，按“2.2.3”项下进行测定，计算回收率和rsd。结果平均回收率为99.8%，rsd＝1.8%。
精密度实验：取同一批新制备样品，按“2.2.3”项下方法连续测定6次，结果吸光度的rsd为1.2%，
重复性实验：取同一批冻干粉针若干支，制备6份样品溶液，并按“2.2.3”项下方法进行测定，结果吸光度的rsd为1.9%，
稳定性实验：取同一批新制备样品，分别于0，2，4，6，8，12，24 h按“2.2.3”项下方法测定，结果样品溶液在24 h内稳定。
2.3.5 样品含量测定取3批样品各2支，分别置于2 ml容量瓶中，各加少量水溶解后稀释至刻度，摇匀，按“2.2.3”项下方法进样，记录色谱图，取峰面积，从标准曲线上读出供试品溶液中whitmanin的含量。结果见表1。表1 样品含量测定结果（略）
2.4 蚂蟥冻干粉针的稳定性考察将蚂蟥冻干粉针在温度（25 ± 2）°c，相对湿度（60 ± 10）%的条件下放置12个月，分别考察0，1，2，3，6，12月6个时间点的稳定性情况。结果，蚂蟥冻干粉针的形状、溶液澄明度、溶液ph值及主成分whitmanin的含量在12个月之中变化非常小，表明蚂蟥冻干粉针的稳定性良好。
3讨论
由于蚂蟥活性成分溶液ph值呈酸性，因此本制品在酸性条件下稳定性强于碱性条件。加入冻干保护剂氯化钠后，制剂在ph达到7时仍很稳定，但为了制剂的安全，作者选定在冻干前将提取液的ph值调节为（6.0 ± 0.5）。
whitmanin是作者从蚂蟥中分离出的抗凝活性很强的物质，由于目前蚂蟥没用明确的化学指标，故此试验以whitmanin作为含量测定指标，最终确定了蚂蟥冻干粉针的处方及工艺。
作者首次将蚂蟥提取液制成冻干粉针，并对其进行了含量测定和稳定性考察。结果表明，蚂蟥冻干粉针性质稳定，且制备工艺和方法适宜推广应用。
【参考文献】
［1］zhong s, cui z, sakura n, et al. a rapid method for isolation and purification of an anticoatulant from whitmania pigra ［j］. biochemical chromatography, 2007, 21: 439.
［2］钟 山，杨得坡，崔 征．蚂蟥中抗凝血活性成分的研究 ［j］．中国中药杂志，2008，33（23）：2781.
［3］钟 山，杨得坡，崔 征，等．蚂蟥中抗凝血活性组分的提取精制工艺研究［j］．中成药，2009：8.
［4］钟 山，崔 征，王 东，等．水蛭注射液抗血栓与抗凝血作用［j］．沈阳药科大学学报，2006，23（7）：456.
