作者：杨春艳，刘朝奇，邹坤，汪鋆植，周永芹，刘小琴

【摘要】  　　目的通过体外细胞培养技术，探讨开口箭皂苷的细胞毒活性及其机制，为进行深层次研究提供依据。方法mtt比色法检测细胞活力，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡。结果mtt结果显示，开口箭总皂苷、30%皂苷和70%皂苷对hela和hepg2细胞的抑制作用显著，与阴性对照组相比有非常显著性差异（p<0.005）。开口箭总皂苷、30%皂苷和70%皂苷和环磷酰胺对hela细胞ic50分别为1 372.92，3 138.51，729.72，3 459.08 μg/ml；对hepg2细胞ic50分别为1 221.39，2 657.53，562.70，3 668.51μg/ml。流式细胞仪检测结果显示，开口箭总皂苷、30%总皂苷在浓度为2 500μg/ml时，70%总皂苷和环磷酰胺在浓度为1 250 μg/ml时主要将hela细胞细胞周期阻滞于s期，且能够诱导肿瘤细胞凋亡。结论开口箭皂苷对hela和hepg2细胞较环磷酰胺具有明显的抑制作用，其中对hepg2细胞株较为敏感，且能将hela细胞细胞周期阻滞于s期从而诱导hela细胞凋亡。

【关键词】  开口箭； 皂苷； mtt法； 流式细胞仪

　　开口箭tupistra chinensis bak.系百合科liliaceae铃兰族开口箭属植物，为著名的传统中药。Www.11665.COm医学古籍记载，开口箭味甘微苦，性寒，主治劳热咳嗽、跌打损伤、风湿痹痛、月经不调、崩漏带下等症；其中中医认为月经不调、崩漏带下即是现代宫颈癌的常见症状。初步实验表明开口箭具有祛痰、抗炎、抑菌及醒酒作用［1，2］。
   
　　本实验室通过实验显示湖北省产开口箭含有甾体皂苷和甾体皂苷元,且含量较高［3］。有关研究结果表明，皂苷具有增强免疫功能、抗辐射、抑制肿瘤生长、抗炎、降血糖等广泛的生物学活性,近年越来越受人们的普遍关注。有研究证实开口箭同属植物皂苷成分有细胞毒活性［4，5］。本文旨在通过体外抗肿瘤实验,观察开口箭皂苷对宫颈癌细胞hela细胞和肝癌细胞hepg2细胞的细胞毒活性,并通过流式细胞仪评价开口箭活性部位对hela细胞细胞周期的影响和诱导该肿瘤细胞凋亡情况。现报道如下。

　　1  材料与仪器

　　1.1  细胞株人宫颈癌细胞（hela）、人肝癌细胞(hepg2)均由三峡大学分子生物学研究所提供。

　　1.2  药品与仪器rpmi-1640为美国gibco公司产品；新生小牛血清为杭州四季青生物材料有限公司产品；hepes为美国sigma公司产品；胰蛋白酶为美国gibco公司产品；四氮唑蓝(mtt)为美国amresco公司产品；环磷酰胺 (cp,江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：07020121)。酶联免疫检测仪(genios tecan)；co2培养箱（日本三洋公司）；ld4-2a离心机(北京医用离心机厂)；96孔板(美国cornning公司)。
   
　　开口箭根茎于2002-07采自湖北省神农架林区，经三峡大学化学与生命科学学院陈发菊副教授鉴定为tupistra chinensis bak.，标本存放于湖北省天然产物研究与利用重点实验室（no.tc200207snj）。

　　2  方法

　　2.1  药物制备开口箭根茎粉碎后，用甲醇回流提取，合并提取液，浓缩后经氯仿脱脂后用水饱和的正丁醇萃取，旋转蒸发回收正丁醇，浓缩液抽干后即得到开口箭总皂苷，配成水液，过大孔树脂柱，水洗， 30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脱，得开口箭4部分皂苷。
   
　　分别取开口箭总皂苷、30%开口箭皂苷、70%开口箭皂苷两个样品，用pbs配制成所需浓度，依次为312.5，625，1 250，2 500，5 000，10 000 μg/ml， 70%开口箭皂苷用pbs配制成所需浓度，依次为156.25，312.5，625，1 250，2 500，5 000 μg/ml，所有受试样品均用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。环磷酰胺 (cp)用dmso将其配置为500 mg/ml。

　　2.2  细胞培养 hela和hepg2细胞用rpmi-1640培养液（另加10mmol/l hepes、2.0 mg/mlnahco3、100 u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10%新生小牛血清），于co2孵箱中37℃，5%co2饱和湿度下培养。贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化传代。

　　2.3  开口箭活性部位对hela和hepg2细胞杀伤作用最佳实验条件的选择mtt法实验条件的初步优化，主要是对溶解药物的溶剂（水、pbs）、加药前的培养时间（6，12，24 h）、药物剂量和细胞密度进行了摸索。其中密度细胞分别取0.1×105，0.5×105，0.8×105，1×105个/ml,接种于96孔培养板,每孔接种100 μl，转板24 h后加不同浓度的开口箭活性部位，继续培养48 h，以mtt法测定吸光度，比较不同细胞密度的线性关系。

　　2.4  mtt比色法［6］mtt比色法按mosmann氏法略加改进。将处于对数生长期的细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度为0.5×105个/ml,接种于96孔培养板,每孔接种100 μl，转板24 h后加100 μl受试药,另设阴性对照组(不加药)、空白调零组（只有pbs）和阳性对照组（环磷酰胺组），每组均设3个复孔，培养48 h，吸弃上清后加mtt(5 mg/ml)100 μl,继续培养4 h后,弃去上清液，加dmso 100 μl,用全自动酶联免疫检测仪于570 nm波长处测定吸光度(od)值［7］,求出ic50。
   
　　抑制率（%）=［阴性对照a570- 加药组a570］/ 阴性对照a570×100%

　　2.5  流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期分1×106个细胞于培养瓶，阴性对照组0.5×106个细胞每瓶，培养24 h；吸弃部分上清后加药混匀（开口箭总皂苷、30%皂苷终浓度2 500μg/ml，70%皂苷和环磷酰胺终浓度1 250 μg/ml），继续培养48 h；于5%co2培养箱中培养48 h后，收集上清于相应标签离心管中，各加1 ml胰酶消化，加4 ml培养液于该培养瓶中，并一起吸至各相应离心管中，各瓶加入5 ml pbs洗涤，洗涤液一起吸入相应离心管中，以2 000 r/min离心5 min；吸弃上清，加入1 ml 80%乙醇和0.5 mmol/ledta(na)2的pbs混合液悬起细胞，轻轻混匀，于4℃固定30 min；弃上清，加pbs 10 ml混匀，以2 000 r/min离心5 min；用500 μl含0.1%tritonx-100 和50 μg/ml  rnase的pbs悬起细胞，转置测定管中，加溴化丙锭pi 100 μl，避光染色17 min（一般15～20 min）；滤膜过滤后上机。

　　2.6  统计学处理 实验数据以 ±s表示，数据分析采用spss10.0统计软件进行。用origin软件，通过半对数拟合直线求ic50值。

　　3  结果

　　3.1  开口箭活性部位对hela和hepg2细胞杀伤作用最佳实验条件的选择为了得到相对稳定并且可靠的实验结果，通过前期预实验并结合大量资料，对该mtt法实验条件进行了初步优化，主要是对溶解药物的溶剂、加药前的培养时间、药物剂量和细胞密度进行了探索。对于溶剂，最初采用的溶剂是水，通过对照发现溶解药物的水对细胞的影响很小，但并非没有，所以正式实验采用pbs溶解药物；对于加药前的培养时间采用了6，12，24 h 3个时间，通过显微镜观察发现加药前培养24 h细胞状态良好，由此选用了加药前培养24 h；对于药物剂量，通过多次预实验，最终选择了最高浓度开口箭总皂苷、30%皂苷为10 000 μg/ml，70%皂苷为5 000 μg/ml，而环磷酰胺为20 000 μg/ml；对于细胞密度，通过多次预实验，采用5种细胞密度即0.1×105，0.5×105，0.8×105，1×105个/ml，同样的药物浓度情况下，开口箭活性部位对hela细胞生长抑制呈最好线性关系的细胞密度是0.5×105 个/ ml，由此选择最佳细胞浓度是0.5×105个/ml。通过这些因素的优化，从而初步排除了其他非药物因素对细胞的影响；而且这两种肿瘤细胞的mtt实验在同一批进行实验，排除了不同环境的干扰，从而得出以下实验结果。

　　3.2   开口箭活性部位对hela细胞的影响结果见表1。表1  开口箭皂苷对hela细胞的抑制作用（略）

　　由表1可以看出，和阳性药环磷酰胺相比，开口箭总皂苷、30%皂苷、70%皂苷对hela细胞的抑制作用显著，与阴性对照组相比有非常显著性差异（p<0.005），且呈良好的量-效关系,开口箭70%皂苷的抑制作用强于总皂苷、30%皂苷。

　　3.3  开口箭活性部位对hela细胞流式细胞术分析结果见图1及表2。表2  开口箭皂苷对hela细胞流式细胞仪分析数据（略）
   
　　从该原始图谱可以看出，阴性对照组hela细胞细胞状态良好，由于药物浓度较高，尤其是开口箭总皂苷、70%皂苷中的凋亡峰急剧上升，这说明高浓度开口箭总皂苷、70%皂苷可以诱导肿瘤细胞坏死。
   
　　从表2可以看出， 2 500 μg/ml开口箭总皂苷、30%皂苷，1 250 μg/ml 70%皂苷和环磷酰胺作用于hela细胞，通过和阴性对照组比较，开口箭总提取物、总皂苷、30%皂苷、70%皂苷、环磷酰胺主要使hela细胞细胞周期阻滞于s期并能诱导肿瘤细胞凋亡。

　　3.4  开口箭活性部位对hepg2细胞的影响 结果见表3。表3  开口箭皂苷对hepg2细胞的抑制作用（略）

　　由表3可以看出，和阳性药环磷酰胺相比，开口箭总皂苷、30%皂苷、70%皂苷对hepg2细胞的抑制作用显著，与阴性对照组相比有非常显著性差异（p<0.005），且呈良好的量效关系,其中开口箭70%皂苷的抑制作用强于总皂苷、30%皂苷。

　　4  讨论
   
　　mtt法是目前抗癌药物体外筛选较好的方法，方法简便、快速，所需细胞数较少，便于大规模进行药物敏感实验。本实验采用mtt法评价开口箭活性部位的细胞毒作用，四甲基偶氮唑盐（mtt）法与其它初筛方法如台盼蓝计数法相比具有主观性低，简便易行等优点，因此被广泛用于抗肿瘤药物的初筛。在优化的实验条件下，采用环磷酰胺做阳性对照，通过对人肝癌细胞hepg2和宫颈癌细胞hela细胞的mtt实验，结果显示开口箭总皂苷、30%皂苷和70%皂苷能够使显著抑制体外培养的hela和hepg2细胞株，与阴性对照组比两者各浓度组均有非常显著性差异（p<0.005），且在此浓度范围内细胞毒作用呈现较明显的剂量依赖性；进一步通过比较两者的半数有效浓度，得出开口箭皂苷对肝癌细胞hepg2较为敏感，即开口箭皂苷抗肿瘤具有一定的选择性。
   
　　采用流式细胞术评价开口箭活性部位对hela细胞细胞周期的影响和凋亡情况，最初采用的是70%乙醇固定过夜，但实验发现该方法容易使细胞成团，而且测出的凋亡峰比较高，由此改进为本实验中的实验方法，细胞成团的情况得到改善，但是凋亡峰明显降低。结果表明，开口箭总皂苷、30%皂苷、70%皂苷和环磷酰胺能够诱导体外培养的hela细胞凋亡，且高剂量的开口箭总皂苷、70%皂苷能够引起细胞坏死；开口箭总皂苷、30%皂苷、70%皂苷和环磷酰胺都能使hela细胞细胞周期阻滞于s期，提示开口箭总皂苷、30%皂苷、70%皂苷能诱导人宫颈癌细胞分化。
   
　　从植物中寻找抗肿瘤药物及抗肿瘤辅助药物，在国内外均为抗肿瘤药物研究的重要组成部分。国际上普遍认为最理想的抗癌药物是那些通过刺激机体自身免疫系统而发挥正常防癌功能的药物。目前应用于临床的抗肿瘤化疗药物多数对机体免疫能力起抑制和破坏作用，在杀灭机体内癌细胞的同时也损伤机体正常组织，副作用大［8］。大量临床和实验资料显示，皂苷具有免疫调节作用。另据文献报道开口箭对s180和hepg2肿瘤细胞株有明显的抑制作用［9］；本实验发现开口箭皂苷对hela和hepg2细胞有较强的细胞毒作用，而且开口箭皂苷能够诱导hela细胞凋亡，且能够将hela细胞细胞周期阻滞于s期从而诱导hela细胞分化。因此对开口箭皂苷的抗肿瘤作用及机制值得进一步研究。

【参考文献】
  　　［1］杨春艳,邹坤,杨兴海,等.开口箭祛痰、抗炎和抑菌实验研究［j］.中国民族民间医药杂志,2005，14（2）:103.

　　［2］汤子春,邹坤,汪鋆植,等.开口箭与筒鞘蛇菰提取物的醒酒作用的实验研究［j］.时珍国医国药,2006,17(11):2163.

　　［3］黄丽,廖全斌,邹坤,等.开口箭中甾体皂苷元含量的测定［j］.三峡大学学报(自然科学版),2003,25(6):562.

　　［4］沈平，王三龙,杨崇仁,等.弯蕊开口箭中的多羟基甾体皂甙元［j］.植物学报,2003,45(5):626.

　　［5］pan w b,chang fr, wei lm, et al. new flavans, spirostanol sapogenins, and a pregname genin from tupistra chinensis and their cytotoxicity［j］. j. nat. prod.,2003,66(2):161.

　　［6］司徒镇强,吴军正.细胞培养,第1版［m］.西安:世界图书出版公司,2004:199.

　　［7］徐叔云.药理实验方法学,第3版［m］.北京:人民卫生出版社,2002：1762.

　　［8］罗祖友,杨晓萍，吴谋成.藤查多糖抗肿瘤及免疫调节作用的研究［j］.食品科学，2007，28（8）：457.

　　［9］朱正光,余传林,蔡 晶,等.开口箭提取物的抗肿瘤作用研究［j］.中药材,2006,29(3):277.