【摘要】  　　目的研究中药复方克瘤丸3种提取方法的提取物体外对人肺癌细胞株a549抑制作用，探讨克瘤丸剂型改革的方向。方法采用mtt法测定克瘤丸3种提取方法的提取物对人肺癌细胞株a549增殖的抑制作用。结果克瘤丸组合提取法取得的提取物抑制率明显高于其他两种提取方法；当药物浓度为5 mg/ml时，对肺癌细胞有明显的抑制作用；克瘤丸对肺癌细胞株增殖的抑制呈一定的时间和浓度的依赖性，随着时间和浓度的增加逐渐增强。结论克瘤丸体外具有显著抑制人肺癌细胞株a549的作用，组合提取法有望成为今后剂型改革的研究方向。

【关键词】  克瘤丸； 提取方法； 人肺癌细胞株a549

　　abstract：objectiveto compare the inhibitory influence among three distill methods of keliu pill on the proliferation of human lung cancer cell line a549 and to research the best form of medication. methodskeliu pill was extracted by three methods, and the effects of three extracts on human lung cancer cell line a549 were observed by mtt assay. resultsthe inhibitory rate of keliu pill extracted by integrated extracted method was the best, and it had remarkable inhibitory effect on human lung cancer cell line a549 at the concentration of 5-10mg/ml. in addition, the inhibition of keliu pill on proliferation of cell growth was in time-depended manner to some degree and the effect was enhanced with time. conclusionkeliu pill  has remarkable effect influence on human lung cancer cell line a549 in vitro. integrated extracted method  is valuable form of medication.

　　key words：keliupill;  distill method;  human lung cancer cell line a549
   
　　我科在学习历代中医文献，结合多年临床经验和反复临床实践的基础上，围绕肺癌的病机特点，提出了“祛瘀解毒，扶正抗癌”的治疗大法，创研出治疗晚期非小细胞肺癌具有较好疗效的克瘤丸制剂（苏药制字 z04000531）。WwW.11665.CoM克瘤丸用于临床已有7年之久，临床实践证明，克瘤丸具有一定的稳定瘤体、抑制肿瘤生长的效果，与化疗合用具有提高疾病控制率的作用［1，2］。实验研究显示克瘤丸对动物移植性肿瘤有明显的抑制作用［3］和免疫提高作用［4］。鉴于克瘤丸在临床抑癌、抗转移中所显示的良好效果，本实验将通过克瘤丸对人肿瘤细胞的生长抑制作用的实验研究，从体外的研究中验证克瘤丸的抗肿瘤作用。由于克瘤丸的剂型为丸剂，制作方法为研末，水泛为丸，每天15 g的剂量，需服用3瓶盖，有些病人不易接受，本实验试图进行改进剂型的摸索以期找到合适的浓缩剂型。

　　1  材料

　　1.1  实验细胞株人肺腺癌a549细胞株由本实验室常规培养，生长于含10%小牛血清的rpmi1640完全培养液中，37℃恒温，5%co2，饱和湿度培养箱中生长。取对数生长期细胞用于实验。

　　1.2  试剂rpmi1640培养液(gibco公司产品)；mtt(sigma公司产品，以生理盐水配制成5 mg/ml浓度)；二甲基亚砜（dmso，上海凌峰公司产品，分析纯）。

　　1.3  克瘤丸购自江苏省中医院药房，批号20041201。

　　2  方法

　　2.1  克瘤丸不同提取物的制备

　　2.1.1  样品ⅰ组合提取法，取200 g粗粉co2超临界萃取后，药渣醇提（70％乙醇）后合并提取液，微波真空干燥，即为样品i的浸膏（4.39 g粗粉/g）。

　　2.1.2  样品ⅱ半仿生提取法，取200 g粗粉加ph为1酸水提取再加ph为8碱水提取，合并提取液，浓缩成稠膏后微波真空干燥(5.13 g粗粉/g)。

　　2.1.3  样品ⅲ水提法，取200 g粗粉加水提取滤过，浓缩成浸膏，再微波真空干燥（3.9 g粗粉/g）。
   
　　称取适量各样品，蒸馏水配置至1 g/ml（相当于生药）。灭菌备用。
   
　　配药：将上药用完全培养液于实验前稀释后得5种终浓度： 20，10，5，2.5，1.25 mg/ml供实验用。以上药物均实验前新鲜配用。

　　2.2  四甲基偶氮唑蓝(mtt)显色法在含10%小牛血清的1640培养液中培养细胞，在细胞达到指数增长期时用于实验。记数细胞浓度为2.5×104/ml，接种于无菌的96孔培养板中。每孔加入肿瘤细胞悬液200 μl，培养24 h后吸去原有的培养液，分别加入各200 μl的5种不同浓度克瘤丸，设空白对照孔加完全培养液，实验对照孔加肿瘤细胞，每组均为5复孔。混匀后置于37℃，5% co2培养箱中继续培养24 h。于结束前4 h每孔加入20 μl浓度为5mg/ml mtt，继续培养4 h后吸去全部上清液，每孔加入二甲基亚砜200 μl溶解液，微型混合器振荡10～15 min，充分溶解，用酶联免疫检测仪于620 nm波长处测定光密度od值，按抑制率计算公式计算抑制肺癌细胞的百分率。

　　2.3  最佳药物提取方法的确定用上述方法得出克瘤丸不同提取方法对肺癌细胞的作用。

　　2.4  最佳药物浓度的确定用上述方法得出克瘤丸不同浓度对肺癌细胞的作用，选取的不同药物作用浓度分别为：20，10，5，2.5，1.25 mg/ml。

　　2.5  最佳药物作用时间的确定用上述方法得出克瘤丸不同时间对肺癌细胞的作用，选取的不同药物作用时间分别为: 12，24，36，48，72 h。

　　2.6  肿瘤细胞抑瘤率计算公式

　　抑瘤率（%）=1-(od实验组-od空白组)(od实验组-od空白组)×100%

　　3  结果

　　3.1  3种提取方法所得提取物体外对肺癌细胞株抑制作用比较克瘤丸样品ⅰ抑制率明显高于其他二种提取方法，样品ⅱ的作用较弱，样品ⅲ几乎没有抑制作用，因此，选取样品ⅰ进行下一步实验。结果见表1。表1  克瘤丸3种提取物体外对肺癌细胞株抑制作用比较（略）

　　3.2  不同浓度、不同时间克瘤丸i体外对肺癌细胞株抑制作用比较加药后培养48 h时抑制率自低浓度到高浓度逐渐上升，1.25～2.5 mg/ml时，没有明显的抗肿瘤作用，5 mg/ml开始，抑瘤率处于较高的水平，随着剂量的增加，抑制率逐渐上升。同时，随着作用时间的延长，抑制率逐渐上升。结果见表2。表2  克瘤丸对体外培养肿瘤细胞的细胞毒作用（略）

　　4  讨论
   
　　克瘤丸3种提取方法，第1种提取完全，提取的有效成分包括脂溶性和醇溶性成分，第2种提取方法为半仿生提取，模仿药丸口服入体内后，经过胃肠酸碱环境的提取后吸收入血液的提取方式，第3种提取方法为简单的水提。结果显示，水提法体外几乎没有抗肿瘤作用。半仿生提取模拟人体内代谢途径，显示有一定的效果。而组合提取法为最优提取方法，可以考虑为以后剂型改进的方向。
   
　　本研究采用mtt法对不同浓度克瘤丸作用下人肺癌细胞72 h的生长情况进行了观察，结果表明克瘤丸对细胞生长的抑制成一定浓度的依赖性：当药物浓度较低时，细胞吸光度值无明显变化。当药物浓度在5 mg/ml，对肺癌细胞有明显的杀伤作用。本研究还显示克瘤丸对细胞生长的抑制成一定时间的依赖性: 克瘤丸对细胞的作用随着时间的增加逐渐增强，从而肯定克瘤丸对肺癌细胞株的体外抑制作用。我们将进一步研究其体内的抑瘤作用及机理。

【参考文献】
  　　［1］戴虹，王居祥，王瑞平，等.克瘤丸治疗恶性肿瘤的临床疗效观察［j］.上海中医药杂志,2006，11：24.

　　［2］杨晨，王瑞平.克瘤丸治疗晚期非小细胞肺癌的临床观察［j］.中医药学刊，2004，22（11）：2090.

　　［3］朱超林，王居祥，王瑞平，等.克瘤丸对小鼠移植性肝癌h22腹水转实体瘤的抑制作用［j］.实用中医内科杂志， 2006，20（4）：378.

　　［4］朱超林,王居祥,王瑞平,等.克瘤丸对移植性肉瘤s180小鼠体质量、胸腺脾脏质量及指数的影响［j］.山东中医杂志，2007，26(6)：411.